周玉飛 岳青芬

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院婦科（河南洛陽 471000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們性觀念、生活習(xí)慣的改變，近年來發(fā)病年齡呈年輕化趨勢［1-2]。組織活檢、宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢查是診斷宮頸癌較為準(zhǔn)確的方法，但在實際中難以用于高?；颊叩拇笠?guī)模篩查。同時，部分患者在首次就診時，因組織活檢等檢查的有創(chuàng)性，依從性較低，因此，尋找經(jīng)濟(jì)、快捷、簡便的診斷及預(yù)后判斷方法仍然是臨床工作的難點［3]。miRNA是一類非編碼單鏈RNA分子，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、遷移等過程，可發(fā)揮類癌基因或抑癌基因作用［4-5]。在胃癌［6]、結(jié)腸癌［7]、胰腺癌［8]等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了多種差異性表達(dá)的miRNA。miRNA-21、miRNA-34a是較早發(fā)現(xiàn)的人類miRNAs［9]，參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在宮頸癌中的研究較少。因此，本研究檢測了不同類型患者組織及血清中二者的表達(dá)差異，分析其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年1-8月我院收治的宮頸癌、CIN、子宮肌瘤患者為研究對象，分為：（1）對照組：因子宮肌瘤行手術(shù)治療的31例患者；（2）CIN L組：低級別上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級的31例患者；（3）CIN H組：高級別上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級、Ⅲ級的28例患者；（4）宮頸癌組：因?qū)m頸癌行手術(shù)治療，且無宮頸相關(guān)病變的42例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證據(jù)確認(rèn)；（2）均行手術(shù)治療；（3）術(shù)前未行放化療；（4）臨床資料完整；（5）知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時合并有其他系統(tǒng)的惡性腫瘤；（2）合并有其他重要系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病或免疫性疾病。

1.2 標(biāo)本與試劑規(guī)范化收集新鮮手術(shù)切除標(biāo)本，切成大小適宜的組織塊，在標(biāo)本離體后30 min內(nèi)置于凍存管，在-70℃條件下保存。在術(shù)前2 d抽取患者血液標(biāo)本，離心后取血清，置于EP管內(nèi)，加入裂解酶，充分震蕩后凍存。miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix、DNA Marker、Protein Marker均購于Takara公司（大連）。PCR引物、DEPC購于博士德生物工程有限公司（武漢）。

1.3 實驗方法（1）組織中總RNA提取：標(biāo)本裝入EP管，滴加Trizol試劑，勻碎后靜置5 min。加入氯仿0.2 mL后震蕩，靜置10 min。4℃，12 000 r/min，離心15 min后管內(nèi)液體分為上中下三層，吸取上層水相至EP管，加入異丙醇，混勻后靜置15 min。再次離心15 min，棄上清，取管底白色沉淀，加入冰乙醇1 mL，混勻后離心，棄上清，重復(fù)操作后，保留沉淀，靜置30 min。加入DEPC水約20～30μL至完全溶解。采用分光光度計計算RNA純度及濃度。取1μg總RNA，電壓100 V，電泳30 min。提取的總RNA，-80℃條件下保存。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。將反應(yīng)體系混勻后，瞬時離心，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，所得cDNA置于-80℃下保存。（3）RT-PCR檢測：以cDNA為模板，嚴(yán)格按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系包括：cDNA 1 μL、2×PCRMaster Mix 10μL、Forward primer 1μL、Reverse primer 1μL、10×SYBER Green 0.5 μL、ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件為，Stage1：95 ℃ 10 min；Stage2（40 cycle）：95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s。（4）PCR產(chǎn)物相對定量檢測：以U6為內(nèi)參對目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理，采用公式RQ=2-△△CT計算表達(dá)量倍數(shù)的變化（RQ：相對表達(dá)量，C：cycles，T：threshold）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行。描述性分析采用頻數(shù)、率±s，統(tǒng)計推斷采用獨立樣本t檢驗、方差分析、卡方檢驗。采用受試工作者特征曲線（ROC）評價miRNA-21、miRNA-34a對宮頸癌的診斷效能。相關(guān)性分析采用Pearson分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測組織表標(biāo)本中miRNA-21、miRNA-34a結(jié)果miRNA-21、miRNA-34a的擴(kuò)增曲線平滑，呈標(biāo)準(zhǔn)S型。溶解曲線表現(xiàn)為單峰，無其他雜峰信號。表明實驗過程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、污染或引物二聚體，檢測結(jié)果可靠。見圖1。

圖1 miRNA-21、miRNA-34a擴(kuò)增曲線（a）、溶解曲線（b）Fig.1 miRNA-21、miRNA-34a amplification curve（a）and dissolution curve（b）

2.2 miRNA-21、miRNA-34a在組織中的表達(dá)水平對照組、CIN L組、CIN H組、宮頸癌組組織中miRNA-21表達(dá)水平的 2-△△CT值分別為（1.12 ±0.46）、（1.22 ± 0.52）、（1.44 ± 0.72）、（5.64 ± 1.57）；miRNA-34表達(dá)水平的 2-△△CT值分別為（0.91 ±0.23）、（0.85 ± 0.28）、（0.53 ± 0.30）、（0.22 ± 0.21）。宮頸癌患者組織組中miRNA-21表達(dá)水平顯著高于其他3組，miRNA-34a表達(dá)水平顯著低于其他3組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）在組織中的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of miRNA-21（a）and miRNA-34a（b）in tissues

2.3 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-34a表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系單因素分析結(jié)果顯示，miRNA-21在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響miRNA-21表達(dá)水平的獨立性危險因素。miRNA-34a在宮頸癌組織中的表達(dá)水平對各臨床病理參數(shù)無明顯影響。見表1、2。

2.4 miRNA-21、miRNA-34a在血清中的表達(dá)水平對照組、CIN L組、CIN H組、宮頸癌組患者血清miRNA-21表達(dá)水平的2-△△CT值分別為（0.95 ±0.36）、（0.93 ± 0.32）、（1.18 ± 0.67）、（3.06 ± 1.86）；miRNA-34表達(dá)水平的2-△△CT值分別為（0.97 ± 0.22）、（0.91 ± 0.26）、（0.59 ± 0.29）、（0.35 ± 0.26）。宮頸癌組患者血清中miRNA-21表達(dá)水平顯著高于其他3組，miRNA-34a表達(dá)水平顯著低于其他3組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

表1 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-34a表達(dá)水平與臨床病理特征的單因素分析Tab.1 Univariate analysis of miRNA-21，miRNA-34a expression and clinicopathological features in cervical cancer tissues

表2 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-34a表達(dá)水平與臨床病理特征的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of miRNA-21，miRNA-34a expression and clinicopathological features in cervical cancer tissues

2.5 miRNA-21、miRNA-34a在組織及血清中表達(dá)水平的相關(guān)性miRNA-21在組織及血清中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.763，P＜0.01）；miRNA-34a在組織及血清中的表達(dá)也呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.908，P＜0.01）。見圖4。

2.6 血清miRNA-21、miRNA-34a對宮頸癌的診斷效能達(dá)最佳臨界點時，miRNA-21對宮頸癌診斷的敏感性為87.9%、特異性為78.8%，曲線下面積（AUC）為0.885；miRNA-34a對宮頸癌診斷的敏感性為92.8%、特異性為64.8%，曲線下面積（AUC）為0.870。見圖5。

圖3 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）在組織中的表達(dá)水平Fig.3 The expression level of miRNA-21（a）and miRNA-34a（b）in tissues

圖4 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）在組織及血清中表達(dá)水平散點圖Fig.4 Scatter plot of expression levels of miRNA-21 and miRNA-34a in tissues and serum

3 討論

圖5 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）對宮頸癌診斷效能的ROC曲線Fig.5 ROCcurve of miRNA-21（a）and miRNA-34a（b）for diagnosis of cervical cancer

目前，人類已知1 000多種miRNA，雖然僅占人類基因組的不到3%，但超過30%的人類基因可能被miRNA調(diào)節(jié)［10]。miRNA參與腫瘤進(jìn)展的可能的機(jī)制包括［11]：（1）異常激活癌基因。（2）沉默抑癌基因。（3）誘導(dǎo)腫瘤血管生成。（4）增強(qiáng)腫瘤侵襲力。（5）調(diào)控凋亡基因。與其他選擇性較強(qiáng)的miRNA相比，miRNA-21的最大特點在于表達(dá)部位廣泛［12]。大多數(shù)研究均認(rèn)為miRNA-21在惡性腫瘤中表達(dá)水平上調(diào)，但也有研究認(rèn)為，miRNA-21可發(fā)揮抑癌基因作用［13]。在本研究中，宮頸癌患者組織及血清中miRNA-21表達(dá)水平顯著高于其他組。這表明，miRNA-21在宮頸癌組織中呈顯著升高趨勢，且與臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miRNA-21主要通過參與調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡作用參與腫瘤進(jìn)展，在不同類型腫瘤細(xì)胞中，作用機(jī)制可能有所不同。但在宮頸癌中，miRNA-21表達(dá)水平升高可使腫瘤惡性特征更為顯著，可作為判斷患者預(yù)后的一個潛在因子。miR-34a是已發(fā)現(xiàn)的最具有腫瘤抑制性miRNA，在許多實體腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌［14]、膀胱癌中［15]均表達(dá)下調(diào)，因此也被認(rèn)為是最具潛力的調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的新靶點。在本研究中，患者組織、血清中miR-34a表達(dá)水平均顯著低于其他組，但患者臨床病理參數(shù)無明顯影響。這表明，隨著正常宮頸上皮組織逐漸向上皮內(nèi)瘤變、癌癥方向轉(zhuǎn)化，其表達(dá)水平逐漸下降，這提示miRNA-34a可能具有抑癌基因作用，但這種抑癌作用機(jī)制尚不明確。不同于miRNA-21的是，miRNA-34a對患者臨床病理特征無明顯影響，筆者推測可能的原因有：（1）miRNA-34a對宮頸癌進(jìn)展的抑制作用弱于其他惡性因素的促進(jìn)作用。因此，實際臨床中難以體現(xiàn)miRNA-34a的保護(hù)作用；（2）miRNA-34a表達(dá)水平較低，數(shù)據(jù)不易顯示出統(tǒng)計學(xué)意義。

miRNA-21、miRNA-34a在組織和血清中呈現(xiàn)相關(guān)性表達(dá)，這是將二者用于臨床診斷的前提條件。在此基礎(chǔ)上，筆者采用ROC曲線評價二者對宮頸癌的診斷效能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-21、miRNA-34a對宮頸癌診斷的敏感性為87.9%、92.8%，特異性為78.8%、64.8%，這表明二者對宮頸癌均具有一定的診斷價值。定期婦科檢查、血清腫瘤標(biāo)志物檢測、宮頸細(xì)胞學(xué)檢測、陰道鏡檢查等是宮頸癌治療后隨訪的主要措施。但實際操作中，存在耗時長、程序繁瑣、費用高、患者依從性差等問題。隨著血清miRNAs檢測的逐漸興起，采血后，根據(jù)血清miRNA水平隨訪評價患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，為患者的術(shù)后隨訪提供了新的途徑。但在目前的研究階段，筆者僅僅能肯定血清miRNA水平對判斷患者預(yù)后有一定作用，但由于缺少對血清miRNA半衰期、水平變化規(guī)律及影響因素等諸多方面的系統(tǒng)性研究，真正將miRNA用于臨床篩查、診斷及隨訪仍有許多問題需要解決。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在宮頸癌組織中及血清中表達(dá)水平明顯升高、miRNA-34a明顯降低，在腫瘤組織及血清中的表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系，提示miRNA-21、miRNA-34a參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，且二者對宮頸癌的診斷有一定的預(yù)測效能。但本研究樣本量較小，隨訪時間較短，尚不能進(jìn)一步說明miRNA-21、miRNA-34a表達(dá)水平與患者預(yù)后及復(fù)發(fā)的關(guān)系，未來在更大樣本量，更長隨訪時間的基礎(chǔ)上進(jìn)行多中心研究，或能得到更有價值的臨床結(jié)論。