鐘春榮 符傳藝 楊杰

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（長沙 410008）；海南省人民醫(yī)院2保健中心四區(qū)，3神經(jīng)外科（?？?570311）

急性腦梗死（acute cerebral infarction）常見于腦血栓形成及腦動脈粥樣硬化等原因，引發(fā)腦血管狹窄，血流減少，嚴(yán)重者腦血管閉塞，進(jìn)而出現(xiàn)局灶性腦缺血，引起相應(yīng)支配區(qū)域的腦組織壞死［1-2]。急性腦梗死具有高致殘率、高病死率及高復(fù)發(fā)率特點(diǎn)，神經(jīng)挽救及功能康復(fù)不甚理想，因此，研究并闡釋急性腦梗死神經(jīng)元死亡的病理生理過程及其調(diào)控是治療的關(guān)鍵點(diǎn)。神經(jīng)元死亡包括自噬、程序性壞死及凋亡等方式，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)程序性壞死在急性腦梗死中扮演著重要的角色［1]。另外研究表明，RIPs是受體相互作用蛋白（receptor interacting proteins），其活化可參與調(diào)控細(xì)胞程序性壞死，抑制其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，尤其是RIP1/RIP3通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3-4]。因此，本課題組通過制作大鼠急性腦梗死模型，研究RIP1/RIP3表達(dá)及其對炎癥反應(yīng)的影響，探討程序性壞死信號通路RIP1/RIP3在急性腦梗死中發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，平均（180±20）g（由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。大鼠飼養(yǎng)于SPF級清潔動物培養(yǎng)室，溫度22～25℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h日夜光照條件下飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器羊抗鼠RIP1一抗和羊抗鼠RIP3一抗、HRP標(biāo)記兔抗羊二抗（武漢博士德生物有限公司），Western blot相關(guān)試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（美國R&D公司），Nec-1（美國Alexis生物技術(shù)公司），酶標(biāo)儀（美國BD公司）等。

1.3 方法

1.3.1 動物分組將36只Wistar大鼠正常適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為急性腦梗死組（采用大腦中動脈阻滯法建立急性腦梗死大鼠模型）、對照組（對照組手術(shù)步驟同急性腦梗死組，但不插入線栓）和5-（1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮（Nec-1）組（在急性腦梗死模型建立后，按0.6 mg/kg腹腔注射RIP1特異性抑制劑Nec-1溶液［2]，連續(xù)注射7 d）。所有大鼠均在7 d后斷頭取腦組織。

1.3.2 急性腦梗死模型的建立采用改良Longa線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞急性腦缺血模型，采用10%水合氯醛按照6 mL/kg對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，依次切開右側(cè)頸部皮膚，肌肉，暴露頸總動脈，于CCA分叉處近心側(cè)做一切口，插入前端蘸有石蠟的3-0單股尼龍縫線，短暫夾閉翼腭動脈（PPA）以防誤插，栓線經(jīng)ICA入顱，插入深度約為20 mm，至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈起始部的血供。采用Zea longa 5分制評分法評估［5]，如出現(xiàn)行走時(shí)身體向偏癱側(cè)，并轉(zhuǎn)圈體征為造模成功。

1.3.3 Western blot檢測海馬組織RIP1和RIP3表達(dá)提取各組大鼠右側(cè)海馬組織：加裂解液，在冰上裂解細(xì)胞15～30 min，5 s×4次超聲破碎細(xì)胞，4℃、10 000×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的Ep管中，蛋白定量后于-20℃保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。分離蛋白采用10%SDS-PAGE電泳，并將膠用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，去除非特異性背景采用室溫，5%脫脂奶粉作用，2 h。分別加入一抗1∶1 000，1∶1 500稀釋的RIP1和RIP3單抗，搖床，4℃，過夜，PBST洗滌，室溫，避光條件下加入1∶2 000兔抗羊二抗，孵育30 min，PBST洗滌，化學(xué)發(fā)光劑顯色1 min，X線片曝光成像，觀察結(jié)果。采用蛋白圖像處理系統(tǒng)軟件和Quantity one軟件分別掃描X線膠片和條帶密度測定。分別重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

1.3.4 ELISA法檢測各組大鼠海馬中TNF-α、IL-6表達(dá)提取各組大鼠的海馬腦組織準(zhǔn)確稱取，加9倍的4℃生理鹽水，經(jīng)研磨攪拌制成10%的組織勻漿，勻漿完畢冰上靜置30 min以利蛋白充分裂解，制得的勻漿液在4℃，12 000 r/min離心15 min×2次，取上清液。實(shí)驗(yàn)操作步驟按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行。主要操作步驟包括：取出96孔板，加50μL依次稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)的反應(yīng)孔中，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。加50μL待檢樣品于反應(yīng)孔中。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下應(yīng)用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組樣本均數(shù)的比較應(yīng)用單因素方差分析。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIP1在急性腦梗死大鼠海馬中的表達(dá)與對照組比較，急性腦梗死組海馬組織中RIP1表達(dá)增加（P＜0.05）；Nec-1可降低急性腦梗死組RIP1表達(dá)，與急性腦梗死組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 RIP3在各組大鼠海馬中的表達(dá)與對照組比較，急性腦梗死組中海馬組織RIP3表達(dá)增加（P＜0.05）；Nec-1可降低急性腦梗死組海馬RIP3表達(dá)，與急性腦梗死組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠海馬中TNF-α和IL-6表達(dá)改變與對照組比較，急性腦梗死組中海馬中炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)增加（P＜0.05）；Nec-1可抑制TNF-α、IL-6表達(dá)，與急性腦梗死組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖1 RIP1在各組大鼠海馬中的表達(dá)Fig.1 Expression of RIP1 in hippocampus of rats in each group

程序性壞死最早由DEGTEREV等［6]發(fā)現(xiàn)并命名，是一種有別于壞死但類似細(xì)胞凋亡，是可調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，其有ATP含量下降、線粒體水腫破裂、自由基和胞內(nèi)鈣升高以及炎癥因子浸潤等壞死樣特征，但需要特定的啟動因子促發(fā)及調(diào)控，其又有凋亡特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死可能存在自噬、程序性壞死及凋亡等病理過程［3，7-8]。另外研究表明，RIP1/RIP3是程序性壞死關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，其廣泛存在于神經(jīng)元中［4]，在死亡信號TNF等刺激下可通過自體磷酸化，促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡發(fā)生［9-11]，RIP1/RIP3表達(dá)水平與細(xì)胞程序性壞死呈正相關(guān)。急性腦梗死TNF-α、IL-6等炎性因子高表達(dá)，表現(xiàn)為非感染性炎癥［12]，RIP1/RIP3在中樞神經(jīng)組織放射性損害及血管痙攣缺血后神經(jīng)組織炎性反應(yīng)中起著關(guān)鍵調(diào)控作用［2，13]，因此，筆者推測RIP1/RIP3可能在急性腦梗死中出現(xiàn)高表達(dá)，程序性壞死可能是急性腦梗死重要病理過程，并扮演著重要作用。但RIP1/RIP3信號通路在急性腦梗死中的表達(dá)和作用尚未見報(bào)道。

本研究通過阻斷大腦中動脈制作大鼠急性腦梗死模型，檢測缺血后患側(cè)海馬組織中RIP1和RIP3表達(dá)，并以海馬TNF-α、IL-6的表達(dá)水平作為腦缺血后炎癥應(yīng)答的指標(biāo)，判斷急性腦梗死中神經(jīng)元程序性壞死與炎癥程度的伴隨關(guān)系。LIU等［10]研究表明TNF-α誘發(fā)大鼠大腦海馬神經(jīng)元程序性壞死。急性腦梗死發(fā)生后，腦組織缺血后產(chǎn)生大量炎性因子諸如TNF-α與IL-6，引發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損害腦組織［11]。在本研究中，急性腦缺血大鼠腦梗死側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元大量壞死，該區(qū)域RIP1/RIP3表達(dá)顯著增加，證實(shí)了程序性壞死是缺血后神經(jīng)元死亡的重要方式，伴隨著神經(jīng)元壞死，生成大量自由基及炎癥因子［14-15]，周圍產(chǎn)生炎性改變。對照組未見TNF-α、IL-6水平升高，程序性壞死與炎癥嚴(yán)重程度正相關(guān)，急性腦缺血后神經(jīng)元有氧呼吸鏈中斷，產(chǎn)生大量氧自由基及炎性因子，TNF-α、IL-6是程序性壞死外源性啟動因子，激活RIP1/RIP3信號通道，促發(fā)程序性壞死。

SU等［16]研究揭示RIP1拮抗劑Nec-1在大鼠腦室出血模型中有保護(hù)作用，研究中發(fā)現(xiàn)Nec-1能夠減輕腦組織水腫，抑制炎性因子諸如IL-6、TNF-α產(chǎn)生，且改善大鼠全腦缺血再灌注損傷后的認(rèn)知和行為能力［17]。本研究中大鼠缺血后經(jīng)Nec-1處理后，RIP1/RIP3表達(dá)水平明顯下降，程序性壞死顯著減輕，伴隨之是TNF-α和IL-6血液中水平下降。因此，筆者認(rèn)為Nec-1能夠通過阻斷RIP1/RIP3通路，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕急性腦缺血后神經(jīng)元程序性壞死，其與出血后神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有共同的路徑，進(jìn)一步證實(shí)了RIP1/RIP3通路與急性腦梗死的密切關(guān)系。

綜上所述，RIP1/RIP3通路參與調(diào)控急性腦梗死神經(jīng)元程序性壞死過程，本研究為急性腦梗死機(jī)制和治療的研究提供新的依據(jù)和靶點(diǎn)。Nec-1可通過調(diào)控RIP1/RIP3通路，抑制炎癥，從而減少神經(jīng)元程序性壞死。但Nec-1是否同時(shí)減輕非程序性壞死或凋亡，尚需要下一步研究證實(shí)。