雷賢英 甘辭海 伍長(zhǎng)學(xué) 王麗 高曉嵐 胡麗蓉 薛鈺婷 文成麗

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院ICU（四川瀘州 646000）

膿毒癥（sepsis）是各種感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是常見(jiàn)的感染性疾病引起的危重癥，病死率極高［1]。膿毒癥的發(fā)病是多因素綜合作用的結(jié)果，當(dāng)機(jī)體遭受病原體感染時(shí)，機(jī)體炎癥效應(yīng)細(xì)胞表面的受體與病原體表面的抗原結(jié)合，通過(guò)抗原、抗體反應(yīng)和酶的活化途徑，激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（核因子NF-κB），最終誘導(dǎo)多種促炎因子以及炎性介質(zhì)的生成和釋放，導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生［2]。有研究表明，右美托咪定具有顯著的器官保護(hù)作用［3]。該實(shí)驗(yàn)以右美托咪定進(jìn)行干預(yù)，研究其對(duì)早期膿毒癥大鼠大量炎癥反應(yīng)的調(diào)控點(diǎn)NF-κB蛋白在肺組織中表達(dá)的影響，探討右美托咪定在膿毒癥救治中的作用機(jī)制，為膿毒癥的治療尋找新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性Wistar大鼠共40只（西南醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用合格證號(hào)：SYXK（川）2013-065），體質(zhì)量200～250 g。均飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中，室溫20～24℃，相對(duì)濕度40%～70%。飼喂全價(jià)顆粒料，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)前均禁食6 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)制模型及藥物處理運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為5組（n=8），分別為對(duì)照組（生理鹽水組）、膿毒癥組（LPS）、右美托咪定低劑量組（D+L）、右美托咪定中劑量組（D+M）、右美托咪定高劑量組（D+H）。采用22號(hào)留置針經(jīng)清醒大鼠尾靜脈穿刺置留置針行尾靜脈保留置管，肝素水封管，用絲線(xiàn)固定以備給藥。對(duì)照組：1 mL/kg注射0.9%生理鹽水；LPS組：以5 mg/kg注射脂多糖復(fù)制膿毒癥大鼠模型（要求10 min以上注射完）；右美托咪定高/中/低劑量組：在5 mg/kg注射脂多糖建模成功后，隨即泵注負(fù)荷劑量右美托咪定（6.5μg/kg，要求10 min以上泵完），然后分別按照4.5、1.5和0.5μg/（kg·h）的速度持續(xù)泵入右美托咪定，泵注6 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取肺組織備用。

1.2.2 標(biāo)本采集40只大鼠均在6 h后用1%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉處死，在無(wú)菌條件下取下部分肺組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)和免疫印跡法行NF-κB相關(guān)分析，并在顯微鏡下觀察肺組織顯微結(jié)構(gòu)的改變。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.3.1 免疫組化法實(shí)驗(yàn)步驟（1）將肺組織切片進(jìn)行HE染色以及顯微結(jié)構(gòu)的觀察：所有標(biāo)本經(jīng)過(guò)40 g/L甲醛溶液固定，梯度脫水及浸蠟，包埋，5μm連續(xù)切片后烤干、再經(jīng)脫蠟、HE染色、透明和封片；（2）肺組織NF-κB蛋白表達(dá)：制備肺組織切片（片厚3μm）。采用二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行操作，肺組織切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后微波熱修復(fù)抗原，再用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性酶，封閉血清，滴加一抗（稀釋度為1∶300）后4℃過(guò)夜，再滴加二抗，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，以陽(yáng)性產(chǎn)物棕黃色為度，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，脫水明中性樹(shù)脂封片，用顯微鏡觀察照相。每一標(biāo)本隨機(jī)選取1張切片，在高倍鏡（×200）下隨機(jī)地選擇5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析并計(jì)算陽(yáng)性區(qū)平均光密度值（MOD）。MOD=積分光密度值（integrated optical density，IOD）/面積，所得數(shù)據(jù)取均值后分析統(tǒng)計(jì)。

按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，觀察細(xì)胞漿顏色，細(xì)胞漿被染成棕黃色的為表達(dá)陽(yáng)性，在每張切片上計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，然后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比值（A）。計(jì)算方法：陽(yáng)性率（A%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/200×100%，每組觀察5張切片，重復(fù)進(jìn)行5次，得到的數(shù)據(jù)取均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3.2 免疫印跡法實(shí)驗(yàn)步驟把碾磨的肺組織粉末加入冰預(yù)冷的RIRA裂解液中提取總蛋白，用Bradford法進(jìn)行定量，按照每孔20μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE（分離膠濃度：10%，濃縮膠濃度：5%），經(jīng)濕轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入含2%脫脂奶粉的TBST稀釋一抗NF-κB p65或β-actin，置于4℃下振蕩孵育過(guò)夜；經(jīng)TBST洗滌后，再與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）進(jìn)行室溫振搖孵育2 h，再經(jīng)TBST洗滌后，加入ECL發(fā)光顯示液于全自動(dòng)凝膠成像分析儀上進(jìn)行曝光，得到的圖像用Gel-Pro analyzer4.0軟件進(jìn)行條帶灰度分析后計(jì)算出目的蛋白與β-actin灰度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)都采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同組間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，若組間差異存在著顯著性，進(jìn)一步采用Student-Newman-Keuls法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色與免疫組化檢測(cè)NF-κB表達(dá)情況將肺組織進(jìn)行HE染色和免疫組化染色后光鏡下觀察。對(duì)照組：未見(jiàn)AGEs陽(yáng)性細(xì)胞（圖1①），肺泡壁薄，支氣管和肺泡上內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)均完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1②）。LPS組：見(jiàn)大量的AGEs陽(yáng)性細(xì)胞（圖1③），支氣管和肺泡上內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)均紊亂，肺泡壁增厚，肺泡壁和肺間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴明顯充血水腫和片狀出血壞死灶（圖1④）。低劑量、中劑量組：見(jiàn)較多AGEs陽(yáng)性細(xì)胞（圖1⑤，⑦），肺泡壁有輕度增厚，部分肺泡內(nèi)可見(jiàn)出血、水腫，少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1⑥，⑧）。高劑量組：見(jiàn)少量AGEs陽(yáng)性細(xì)胞（圖1⑨），支氣管和肺泡上內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，肺泡壁和肺間質(zhì)輕度增厚，少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1⑩）。

圖1 肺組織HE染色與免疫組化檢測(cè)NF-κB表達(dá)（×100）Fig.1 The expression of NF-κB by HE staining and immunohistochemistry

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織NF-κB蛋白量表達(dá)膿毒癥組（LPS組）NF-κB蛋白的表達(dá)明顯，右美托咪定高劑量組（D+H組）NF-κB蛋白的表達(dá)減少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，LPS組肺組織平均光密度（MOD）值與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D+H組肺組織MOD值與LPS組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（表1）。LPS組肺組織陽(yáng)性細(xì)胞所占值（A%）與對(duì)照組組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量組（D+H組）肺組織的陽(yáng)性細(xì)胞所占值（A%）與LPS組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 2）。

2.3 免疫印跡法檢測(cè)肺組織NF-κB蛋白表達(dá)情況如圖2，β-actin片段的大小趨于一致，均清晰且無(wú)雜帶。各組蛋白都有較強(qiáng)的actin條帶出現(xiàn)，表明每組樣品的蛋白總濃度相近，并且各組actin條帶的亮度相似。在實(shí)驗(yàn)組中，LPS組的NF-κB條帶明顯增強(qiáng)，各治療組中，D+H組條帶亮度稍弱，D+M/D+L治療組NF-κB條帶亮度變化不明顯。

表1 肺組織NF-κB蛋白的表達(dá)平均光密度（MOD）值Tab.1 The mean optical density（MOD）of NF-κB protein in lung tissue ±s

表1 肺組織NF-κB蛋白的表達(dá)平均光密度（MOD）值Tab.1 The mean optical density（MOD）of NF-κB protein in lung tissue ±s

注：與對(duì)照組比較，*P=0.001；與LPS組比較，△P=0.014

分組 樣本量 視野/切片MOD對(duì)照組LPS組D+L組D+M組D+H組8 8 8 8 8 60/8 60/8 60/8 60/8 60/8 0.048 8±0.008 8 0.072 0±0.008 4*0.066 0±0.008 9 0.064 0±0.008 9 0.056 0±0.011 4△

表2 各組肺組織NF-κB蛋白的表達(dá)（A%）Tab.2 Theexpression of NF-κBprotein in lungtissue ±s

表2 各組肺組織NF-κB蛋白的表達(dá)（A%）Tab.2 Theexpression of NF-κBprotein in lungtissue ±s

注：與對(duì)照組比較，a P=0.004；與LPS組比較，b P=0.027

分組 樣本量 視野/切片A%對(duì)照組LPS組D+L組D+M組D+H組8 8 8 8 8 60/8 60/8 60/8 60/8 60/8 25.274 0±5.774 1 36.488 0±5.559 4a 30.196 0±4.851 8 30.572 0±5.486 0 28.175 0±5.860 3b

圖2 Western blot檢測(cè)肺組織NF-κB結(jié)果Fig.2 The results of NF-κB in lung tissue by Western blot

3 討論

在機(jī)體受到病原體感染時(shí)，機(jī)體炎癥效應(yīng)細(xì)胞表面受體識(shí)別病原體表面的抗原，再通過(guò)一系列抗原、抗體反應(yīng)及酶的活化途徑，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB），最終誘導(dǎo)炎性介質(zhì)及多種促炎因子的生成和釋放［4]。這些炎性介質(zhì)和促炎因子通過(guò)正反饋形式形成引發(fā)瀑布效應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴，級(jí)聯(lián)擴(kuò)大機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生［5]。

急性肺損傷是引起膿毒癥患者死亡的最重要原因之一，其發(fā)生時(shí)間最早，發(fā)生率最高［6]。

肺組織的炎癥高反應(yīng)性被認(rèn)為是膿毒癥時(shí)病理生理反應(yīng)的組成部分之一，其中引起促炎因子上調(diào)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是膿毒癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵所在［7]。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性休克所致的急性肺損傷動(dòng)物模型中，組織或細(xì)胞NF-κB活性明顯增強(qiáng)，血液和肺泡灌洗液中的炎癥介質(zhì)如IL-6、TNF-α等的含量明顯增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嚴(yán)重膿毒癥時(shí)，通過(guò)激活NF-κB，進(jìn)而啟動(dòng)TNF-α等炎性因子的大量釋放，最終導(dǎo)致嚴(yán)重膿毒癥血清干預(yù)離體培養(yǎng)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［8]。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）與阿片類(lèi)藥物的不同之處是其基本不會(huì)引起呼吸抑制，主要通過(guò)作用于腦組織藍(lán)斑核中的α2受體，參與鎮(zhèn)靜、催眠和呼吸的調(diào)節(jié)［9]。有觀察顯示，給予正常志愿者DEX后，其呼吸類(lèi)似于自然睡眠呼吸狀態(tài)，而給予進(jìn)行人工輔助呼吸的患者DEX后，其高碳酸血癥的發(fā)生率明顯降低，可維持良好的每分鐘通氣量，其呼吸抑制閾值和呼吸暫停次數(shù)也明顯降低［10]。GEZE等［11]的研究顯示，在氣腹前預(yù)給DEX可明顯減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織缺血修飾性白蛋白的產(chǎn)生，從而減輕因氣腹引起的肺損傷；而使用高劑量DEX后能明顯改善高潮氣量通氣模式（HVT）所致呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的肺炎癥反應(yīng)，從而減輕肺水腫發(fā)生［12]。GU等［13]的實(shí)驗(yàn)研究顯示，DEX可通過(guò)激活α2受體依賴(lài)和非依賴(lài)雙重機(jī)制減輕腎缺血-再灌注損傷所致的遠(yuǎn)端肺損傷。另有研究將氯胺酮和DEX聯(lián)合應(yīng)用于失血性休克大鼠模型中，其結(jié)果顯示，急性肺損傷的發(fā)生率明顯減少，呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的發(fā)生率及嚴(yán)重程度明顯下降，具有明顯的肺保護(hù)作用［14]。

基于右美托咪定的抗炎和肺保護(hù)效應(yīng)，本研究通過(guò)免疫組化法對(duì)肺組織NF-κB蛋白進(jìn)行檢測(cè)顯示：與膿毒癥組比較，高劑量DEX組肺組織NF-κB蛋白平均光密度（MOD）值明顯下降（P=0.014），該組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)量明顯減少（P=0.027）；通過(guò)免疫印跡法亦顯示高劑量DEX組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)條帶明顯減弱；光鏡下高劑量DEX組可見(jiàn)支氣管和肺泡上內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，肺泡壁和肺間質(zhì)輕度增厚，少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)。用中、低劑量右美托咪定干預(yù)處理后，肺組織NF-κB蛋白表達(dá)量有一定程度的下降，但變化不明顯（P＞0.05）。這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)論均證實(shí)，高劑量DEX可干預(yù)早期膿毒癥大鼠大量炎癥反應(yīng)的調(diào)控點(diǎn)NF-κB蛋白的表達(dá)，高劑量DEX對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷有明顯的保護(hù)作用。

因此，高治療劑量4.5μg/（kg·h）的右美托咪定可減少早期膿毒癥大鼠肺組織NF-κB蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而抑制下游炎癥因子的釋放，緩解肺損傷，具有肺保護(hù)的作用。