李品玉 劉其禮 張嫄怡 楊堅(jiān) 鄭恒

肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室（廣東肇慶 526000）

大腸癌是發(fā)生在大腸黏膜上皮的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）與直腸癌（rectal cancer，RC），是全球最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤第5位［1]。雖然針對結(jié)直腸癌的治療取得一定進(jìn)步，但總體預(yù)后仍不理想，其主要原因與腫瘤過度增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，針對結(jié)直腸癌增殖與轉(zhuǎn)移的治療成為近些年來的研究熱點(diǎn)。

四羥基二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是從中藥何首中提取的一種水溶性有效成分，其結(jié)構(gòu)與白藜蘆醇相似，僅二位多一個酚羥基并形成了糖苷，均屬于二苯乙烯類［2]。前期針對THSG在結(jié)腸癌中的治療作用筆者開展了一定的研究。TGFβ是腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）最為相關(guān)的因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色［3]。前期筆者發(fā)現(xiàn)THSG通過直接抑制PI3K/AKT通路，從而抑制TGFβ誘導(dǎo)的EMT，提示THSG在抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著潛在的治療作用［4]。當(dāng)前研究報道白藜蘆醇在人白血病、胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌［5-8]等多種腫瘤中能抑制PI3K/AKT/NF-κB通路。而研究證實(shí)PI3K/AKT/NF-κB通路對腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡至關(guān)重要。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性和前期研究，筆者推測THSG有望通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，發(fā)揮其抗癌的藥理學(xué)價值。本研究擬針對THSG對結(jié)腸癌增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制展開探討，為將其開發(fā)成為抗癌藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期為結(jié)腸癌的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480由南方醫(yī)科大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑胎牛血清、RPMI-1640為美國GIBICO公司產(chǎn)品，CCK8試劑購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，二苯乙烯苷（純度＞98%）購于成都百科通生物，順鉑購自sigma公司，PTEN及P-AKT、AKT抗體購于Cell Signaling Technology公司，GAPDH和鼠、兔二抗均購于北京中杉金橋有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CCK8檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的HCT116和SW480細(xì)胞調(diào)整濃度為2×105/mL，每孔100μL接種于96孔板，24 h后吸去培基，分別加入5、10、20 mmol的THSG培養(yǎng)24、48、72 h，隨后每孔加入100μL；含CCK8試劑的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基：CCK8=9∶1）37℃培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀于490 nm處檢測各孔吸光值（A）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對照孔A值）×100%。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡操作步驟按說明書進(jìn)行。HCT116和SW480在不同濃度THSG作用24 h后，PBS洗滌2次，不含EDTA胰酶消化后加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC混勻后再加入5μL PI混勻，室溫避光15 min，上機(jī)檢測。

1.3.3 Western blot將處于對數(shù)生長期的HCT 116和SW480細(xì)胞分別按70%～80%的密度接種于6孔板中，貼壁后加入不同濃度的THSG作用24 h后收細(xì)胞集細(xì)胞，加入RIP裂解液裂解1 h后BCA法測定蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的loading buffer 95℃變性5 min。蛋白用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫1 h后常規(guī)顯色發(fā)光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，分析前先通過Levene法檢測方差齊性，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett′s T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THSG對HCT116和SW480細(xì)胞增殖的影響CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THSG對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW480增殖的抑制呈時間和劑量依賴性。當(dāng)THSG濃度為5 mmol時，作用于HCT116細(xì)胞24、48和72 h細(xì)胞抑制率分別為8.2%、15.133%及22.767%；作用于SW480細(xì)胞24、48和72 h細(xì)胞抑制率分別為5.867%、11.100%及14.733%。當(dāng)THSG濃度為10 mmol時，作用于HCT116細(xì)胞24、48和72 h細(xì)胞抑制率分別為23.800%、34.633%及50.967%；作用于SW480細(xì)胞24、48和72 h細(xì)胞抑制率分別為12.033%、23.200%及44.300%。當(dāng)THSG濃度為20 mmol時，作用于HCT116細(xì)胞24、48和72 h細(xì)胞抑制率分別為48.633%、6.667%及85.500%；作用于SW480細(xì)胞24、48和72 h細(xì)胞抑制率分別為40.100%、58.000%及85.333%。見圖1。

圖1 THSG對HCT116和SW480細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of THSGon HCT116 and SW480 cells proliferation

2.2 二苯乙烯苷對順鉑化療增敏的影響CCK8結(jié)果顯示，與單純使用順鉑相比，不同濃度的順鉑與10 mmol THSG聯(lián)合作用24 h對HCT116和SW480細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)。當(dāng)順鉑濃度為2.5μg/mL時，HCT116和SW480細(xì)胞24 h細(xì)胞抑制率分別為41.98%和36.31%，與THSG聯(lián)合使用后HCT116和SW480細(xì)胞24 h抑制率分別為55.48%和57.14%，與單獨(dú)使用順鉑相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.943，P＜ 0.05；t=-7.199，P＜0.05）；當(dāng)順鉑濃度為5μg/mL時，HCT116和SW480細(xì)胞24 h細(xì)胞抑制率分別為67.63%和58.26%，與THSG聯(lián)合使用后HCT116和SW480細(xì)胞24 h抑制率分別為77.33%和82.00%，與單獨(dú)使用順鉑相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-7.147，P＜0.05；t=-11.726，P＜0.05）；當(dāng)順鉑濃度為10μg/mL時，HCT116和SW480細(xì)胞24 h細(xì)胞抑制率分別為86.01%和79.34%，與THSG聯(lián)合使用后HCT116和SW480細(xì)胞24 h抑制率分別為93.03%和91.70%，與單獨(dú)使用順鉑相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.880，P＜0.05；t=-14.573，P＜ 0.05），見圖2。

圖2 THSG與順鉑聯(lián)合使用對HCT116和SW480細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of combination treatment of THSGand cisplation on HCT116 and SW480 cells proliferation

2.3 二苯乙烯苷對CRC細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，5 mmol THSG作用于HCT116和SW480細(xì)胞時，細(xì)胞早期凋亡率分別為（6.33±0.45）%和（4.63±0.25）%，10 mmol THSG作用于HCT116和SW480細(xì)胞時，細(xì)胞早期凋亡率分別為（11.8±0.56）%和（10.53±0.71）%，20 mmol THSG作用于HCT116和SW480細(xì)胞時，細(xì)胞早期凋亡率分別為（38.87±2.32）%和（40.47±1.06）%。多重結(jié)果比較表明，THSG可誘導(dǎo)HCT116和SW480細(xì)胞凋亡，且隨THSG濃度的增加，HCT116和SW480細(xì)胞早期凋亡率也隨之增加（F=562.515，P＜0.001；F=2241.404，P＜ 0.001），見圖3。

2.4 二苯乙烯苷對PI3K/AKT/NF-κB通路的影響Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，THSG處理組PTEN的蛋白表達(dá)隨濃度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢，而p-AKT、p-IKKβ的表達(dá)隨濃度的增加呈遞減趨勢，提示THSG可以抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，見圖4。

圖3 Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測不同濃度THSG作用24 h對HCT116和SW480細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effect of different concentration treatment of THSGon HCT116 and SW480 cells apotosis for 24 h was detected by Annexin V/PIflow cytometry

圖4 THSG對HCT116和SW480細(xì)胞PI3K/AKT/NF-κB通路的影響Fig.4 The effct of THSGon PI3K/AKT/NF-κBpathway in HCT116 and SW480 cells

3 討論

近年來，隨著國民生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，名列各大惡性腫瘤第5位［1]。針對早期腫瘤，手術(shù)切除是首選治療策略，而晚期腫瘤則依賴放化療、分子靶向治療等綜合治療［9]。由于缺乏常規(guī)體檢篩查，有近一半以上的患者確診時已處于晚期［10]。因此，尋找和開發(fā)新的綜合治療策略，具有重大的臨床意義。

中醫(yī)是我國的國粹，中醫(yī)藥及其提取物在抗腫瘤治療上越來越受矚目。研究證實(shí)多種中藥單體如青蒿烯［11]、姜黃素［12]、雷公藤甲素［13]等通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抑制腫瘤相關(guān)信號通路等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤效果。四羥基二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是中藥何首烏提取物之一，與白藜蘆醇存在結(jié)構(gòu)相似性［2]。而白藜蘆醇已被證實(shí)通過抗氧化作用和干擾腫瘤相關(guān)信號傳導(dǎo)如PI3K/AKT通路、NF-κB通通、mTOR通路、MAPK通路、Hedgehog（Hh）通路等發(fā)揮重要的抗癌抑癌的作用［5-8，14]?；诮Y(jié)構(gòu)相似性，筆者推測THSG可能也發(fā)揮著潛在抗癌價值。在前期研究中，筆者也證實(shí)THSG通過抑制PI3K/AKT通路，拮抗TGFβ誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT，從而抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移［4]?；仡橳HSG相關(guān)研究，LIU等［15]報道THSG的酚羥基通過給出氫原子，自身形成二聚體，從而清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。小鼠心肌細(xì)胞中，THSG則拮抗阿霉素誘導(dǎo)的丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，改善化療藥物的心臟毒性［16]。心腦血管方面，THSG抑制炎性因子如CRP、IL-6、TNFα等產(chǎn)生，進(jìn)而改善動脈粥樣硬化［17]。在其他腫瘤領(lǐng)域，THSG也被證實(shí)發(fā)揮抗腫瘤功能。乳腺癌中，THSG抑制MCF-7細(xì)胞PI3K/AKT通路，從而抑制細(xì)胞增殖［18]；黑色素瘤B16細(xì)胞中，THSG則抑制MAPK通路，抑制細(xì)胞增殖［19]。結(jié)合THSG分子結(jié)構(gòu)分析、前期相關(guān)研究基礎(chǔ)和國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，筆者有理由相信THSG在結(jié)腸癌治療中發(fā)揮著潛在抗癌作用，本研究擬探究THSG在結(jié)腸癌中的生物學(xué)功能及其相關(guān)分子機(jī)制，為將來臨床應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

通過對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW480給予THSG處理，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)增殖抑制，并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，該研究結(jié)果與乳腺癌［18]和黑色素瘤［19]中的研究報道相符，進(jìn)一步證實(shí)THSG的抗癌作用。有研究報道白藜蘆醇在膀胱癌中可增加順鉑化療敏感性［20]，基于結(jié)構(gòu)相似性，本研究接下來探索THSG是否能增加結(jié)直腸癌細(xì)胞順鉑化療的敏感性。通過CCK-8和流式細(xì)胞儀技術(shù)，本研究均證實(shí)較單用順鉑化療組，THSG聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞抑制率更高，化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率也明顯增加，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次說明THSG不但抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW480的增殖，而且可增加順鉑化療敏感性，是一種良好的化療輔助藥物，具有較大的臨床治療價值，但THSG介導(dǎo)增殖抑制和化療敏感性的潛在分子機(jī)制仍不清楚。白藜蘆醇在多種惡性腫瘤中可通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路抑制從而抑制癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮其抗癌作用，同時，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中THSG可抑制PI3K/AKT通路［18]，前期研究筆者進(jìn)一步確認(rèn)了THSG在腸癌中針對PI3K/AKT通路的抑制作用［4]。文獻(xiàn)報道THSG在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中通過抑制NF-κB通路來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［21]，而NF-κB通路是PI3K/AKT通路的下游之一。PI3K/AKT/NF-κB通路是經(jīng)典的腫瘤相關(guān)信號通路，PTEN的缺失導(dǎo)致PI3K/AKT通路的活化，磷酸化的AKT促進(jìn)IKKα和IKKβ磷酸化，激活NF-κB入核，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、EMT、腫瘤發(fā)展、化療耐藥等多個生物學(xué)功能［22]。因此筆者推測THSG可能在結(jié)直腸癌中通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號軸，發(fā)揮抑癌功能。Western blot發(fā)現(xiàn)隨著THSG刺激濃度的增加，HCT116和SW480細(xì)胞中PTEN的水平逐漸升高，AKT的蛋白磷酸化水平則遞減，同時IKKβ的磷酸化水平也受到抑制，說明THSG抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞中的PI3K/AKT/NF-κB信號通路。

綜上，本研究首次探討了何首烏提取物THSG對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，本研究首次證實(shí)THSG抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且增加順鉑的化療敏感性，其潛在的分子機(jī)制可能與其誘導(dǎo)PTEN蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關(guān)。筆者的研究為將來應(yīng)用THSG抗腫瘤和輔助化療用藥提供了有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究除了以上發(fā)現(xiàn)，仍存在不足的地方。雖然多種腫瘤中均證實(shí)了THSG的抗癌效果，本研究也在腸癌中針對腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移開展了一系列相關(guān)研究并取得了一定的陽性結(jié)果，但目前THSG作用的直接藥理學(xué)靶點(diǎn)仍未被發(fā)現(xiàn)，THSG的抗癌作用也缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，其調(diào)控的其他腫瘤相關(guān)信號通路如MAPK、mTOR Hedgehog（Hh）等也缺乏進(jìn)一步論證。后續(xù)工作中，筆者將綜合高通量手段，篩選THSG相關(guān)的作用靶點(diǎn)，構(gòu)建THSG抗癌分子網(wǎng)絡(luò)，明確THSG的確切分子機(jī)制，為其將來的臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。