沈煥嘉 莫沁杏 陳玉柳 劉蕓

廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室（廣州 511436）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種發(fā)病率和致死率較高的缺血性心臟病，表現(xiàn)為持續(xù)缺血缺氧，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和左室重構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心衰，是嚴(yán)重危害公眾健康的心血管疾?。?]。其中心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的重要原因之一［2-3]。在AMI過程中，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等都會引起心肌細(xì)胞凋亡，從而造成心肌損傷。因此，深入研究AMI的分子機(jī)制，尋找減輕心肌缺血損傷、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的有效靶點(diǎn)，具有十分重要的意義。

Endophlin A2（EndoA2）是一種突觸頭端接觸蛋白，一般認(rèn)為與細(xì)胞內(nèi)吞作用有關(guān)，廣泛分布于各組織中［4]。最近的研究表明，EndoA2可通過SH3結(jié)構(gòu)域與ClC-3結(jié)合，調(diào)節(jié)ClC-3在胞漿胞膜的分布，進(jìn)而調(diào)控容積調(diào)節(jié)型氯電流開放，調(diào)節(jié)血管重構(gòu)［5]。另外也有研究表明，EndoA2參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞泡沫化［6]。本課題組的前期研究也證實(shí)，EndoA2通過抑制Bax從胞漿轉(zhuǎn)位線粒體，減少細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠腦基底動脈平滑肌細(xì)胞凋亡［7]。上述研究表明，EndoA2與心血管疾病密切相關(guān)。然而，EndoA2是否參與調(diào)節(jié)AMI后心肌重構(gòu)過程，至今尚未有報(bào)道。本研究采用氧葡萄糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞急性缺血損傷，探討EndoA2對心肌細(xì)胞急性缺血損傷的影響，并初步探索PTEN/Akt信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibico公司。Ad-EndoA2腺病毒委托上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司合成并完成滴度測定。EndoA2干擾鏈及轉(zhuǎn)染試劑購自美國Qiagen公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢凱基公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天。Caspase-3、PTEN、p-PTEN、PDK1、p-PDK1、Akt、p-Akt購自美國Cell Signaling Technology公司。鼠單抗GAPDH、Ⅱ抗山羊抗兔（IgG）和Ⅱ抗山羊抗小鼠（IgG）購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或者國產(chǎn)分析純。

1.2 主要方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃和5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上用0.25%胰酶消化傳代。在各實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束前12 h進(jìn)行OGD處理。棄原有培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞3遍，加入適量DMEM低糖培養(yǎng)基，放置于37 ℃三氣缺氧（N2∶CO2∶O2＝94%∶5%∶1%）培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧12 h。

1.2.2 干擾鏈與腺病毒轉(zhuǎn)染參照文獻(xiàn)［7] 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞融合度為30%～40%，取100μL DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋10μL hiperfect，再加入20 nmol/L的干擾鏈。室溫混合10 min，將混合物均勻加入含有1.9 mL培養(yǎng)基的小皿中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。6 h后換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，第2天細(xì)胞密度約為40%～50%，取100μL無血清無抗生素的培養(yǎng)基稀釋病毒使MOI值適合于實(shí)驗(yàn)，加入含有900μL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。6 h后換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞存活率參照CCK-8試劑盒說明書操作，將細(xì)胞以每孔104的密度在96孔板中培養(yǎng)24 h，經(jīng)過不同處理后，加入CCK-8（10μL/孔）于37℃孵育4 h。通過酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測吸光度值（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率按照試劑盒說明書操作。細(xì)胞懸液在4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清，清洗兩遍后加入1×binding buffer（5× 105～ 5× 106細(xì)胞/mL）。分別向混合懸液加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕柔混勻，室溫避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)根據(jù)參考文獻(xiàn)［8] 檢測PTEN、PDK1、Akt、GAPDH及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。簡而言之，PBS清洗細(xì)胞后，加入裂解液和蛋白酶抑制劑裂解30 min，然后12 000 r/min離心12 min，取上層清液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并制成蛋白樣品。經(jīng)SDSPAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST漂洗2次后，用3%BSA/TBS稀釋Ⅰ抗4℃孵育過夜。第2天TBST漂洗3次后，Ⅱ抗室溫孵育1～2 h，TBST漂洗3次。經(jīng)ECL顯色液曝光成像，分析條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或者單因素方差分析（one way ANOVA）。數(shù)據(jù)均以表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EndoA2提高OGD后心肌細(xì)胞的存活率為了探討EndoA2對OGD處理后心肌細(xì)胞存活情況的影響，在H9C2心肌細(xì)胞上轉(zhuǎn)染EndoA2 siRNA沉默EndoA2或轉(zhuǎn)染Ad-EndoA2過表達(dá)EndoA2，再OGD處理6 h，CCK-8檢測H9C2心肌細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，OGD處理后細(xì)胞存活率降低，沉默EndoA2細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低，而過表達(dá)EndoA2細(xì)胞存活率明顯升高。與OGD組相比，轉(zhuǎn)染Ad-lacZ或negative，細(xì)胞存活率無明顯變化。見圖1。結(jié)果表明EndoA2可提高OGD后心肌細(xì)胞的存活率。

2.2 EndoA2抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡為了探討EndoA2對心肌細(xì)胞凋亡的影響，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示單純轉(zhuǎn)染Ad-EndoA2或siRNA對心肌細(xì)胞凋亡無明顯影響。OGD處理后心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，沉默EndoA2進(jìn)一步促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)EndoA2則抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。見圖2。結(jié)果表明EndoA2可明顯改善OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

圖1 EndoA2提高OGD后心肌細(xì)胞的存活率Fig.1 EndoA2 increased the cell viability of cardiomyocytes after OGD

2.3 Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)為進(jìn)一步探討EndoA2對心肌細(xì)胞凋亡的影響，用Western blotting檢測凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，OGD處理后，活化的Caspase-3表達(dá)增多，與OGD組相比，沉默EndoA2進(jìn)一步促進(jìn)Caspase-3活化，而過表達(dá)EndoA2則抑制Caspase-3活化，見圖3。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)EndoA2可改善OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

圖2 EndoA2抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡Fig.2 EndoA2 inhibited the apoptosis of cardiomyocytes induced by OGD

2.4 EndoA2通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt通路抑制心肌細(xì)胞急性缺血損傷為了探討EndoA2抑制心肌細(xì)胞急性缺血損傷的分子機(jī)制，采用Western blot檢測PTEN/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，OGD促進(jìn)PTEN磷酸化，抑制PDK1和Akt磷酸化。沉默EndoA2進(jìn)一步促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的PTEN磷酸化，抑制PDK1和Akt磷酸化，過表達(dá)EndoA2則發(fā)揮相反的作用，見圖4。

圖3 EndoA2抑制OGD誘導(dǎo)的Caspase-3活化Fig.3 EndoA2 inhibited the activation of Caspase-3 induced by OGD

圖4 EndoA2對PTEN/Akt通路的影響Fig.4 The effect of EndoA2 on PTEN/Akt signaling pathway

3 討論

AMI是一種嚴(yán)重危害人類健康的缺血性心臟病。主要由于冠狀動脈狹窄，導(dǎo)致心肌供血不足，從而出現(xiàn)心肌代謝功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)以及心功能異常［9]。心肌重構(gòu)是心功能逐步下降導(dǎo)致心衰的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，包括梗死區(qū)心肌細(xì)胞缺血壞死、室壁纖維化和變薄以及非梗死區(qū)膠原沉積［10]。臨床上對于AMI的治療措施主要是一些補(bǔ)救性的治療方法，在減輕心肌損傷，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)等方面存在明顯的不足。因此，尋找特異性逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，保護(hù)缺血心肌的分子靶點(diǎn)，對改善AMI后心臟預(yù)后具有十分重要的意義。

Endophilin是在篩選小鼠胚胎基因cDNA文庫時(shí)，因含有一個(gè)富集多聚脯氨酸的SH3結(jié)構(gòu)域而被發(fā)現(xiàn)［11]。Endophilin由兩個(gè)亞型組成，分別是endophilin A和endophilin B。EndoA2作為其中的一個(gè)成員，被廣泛報(bào)道可以和內(nèi)吞蛋白結(jié)合，影響膜的內(nèi)陷、裂變到晚期的脫殼，參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程［12-13]。另外的研究表明，EndoA2的SH3結(jié)構(gòu)域與BPGAP1富集脯氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合調(diào)節(jié)表皮生長因子受體的內(nèi)吞［14]。EndoA2的SH3結(jié)構(gòu)域與單克隆非特異性抑制因子β結(jié)合，抑制酵母多糖的吞噬［15]。除了內(nèi)吞功能，EndoA2的非內(nèi)吞功能也被廣泛報(bào)道。EndoA2可以促進(jìn)容積調(diào)節(jié)型氯通道蛋白ClC-3從胞漿向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)血管重構(gòu)［5]。本課題組的前期研究也證實(shí)EndoA2通過抑制Bax從胞漿轉(zhuǎn)位線粒體，抑制線粒體通路誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)血管重構(gòu)［7]。此外，EndoA2還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞泡沫化［6]。以上研究證實(shí)，EndoA2對動脈粥樣硬化、血管重構(gòu)等心血管疾病具有重要的調(diào)節(jié)作用。那么，EndoA2是否能夠改善心肌急性缺血損傷，進(jìn)而影響AMI后心肌重構(gòu)呢？

在本課題中，筆者通過OGD建立心肌細(xì)胞急性缺血模型。結(jié)果顯示，過表達(dá)EndoA2明顯抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，沉默EndoA2則進(jìn)一步促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。EndoA2改善心肌急性缺血損傷的分子機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。PI3K是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的重要因子，在糖尿病心肌病、缺血/再灌誘導(dǎo)的心肌損傷以及心肌肥大模型中，PI3K/Akt通路被激活［16]。PTEN是調(diào)節(jié)PI3K活性的負(fù)性調(diào)節(jié)子。研究表明，失活PTEN明顯抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大［17]。此外，在缺血心肌，TIEG1通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt通路，改善缺血誘導(dǎo)的心肌損傷［18]。以上結(jié)果提示PTEN在心血管疾病的病理生理過程中具有重要作用。那么，PTEN在EndoA2改善心肌急性缺血損傷過程中是否發(fā)揮調(diào)控作用呢？為了解決這個(gè)問題，本研究采用Western blotting的方法檢測了PTEN、PDK1以及Akt的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EndoA2抑制PTEN磷酸化，促進(jìn)PDK1和Akt磷酸化，沉默EndoA2則發(fā)揮相反的作用。提示PTEN/Akt通路參與了EndoA2改善心肌急性缺血損傷過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EndoA2明顯抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表明EndoA2具有改善心肌細(xì)胞急性缺血損傷的作用，其機(jī)制可能與PTEN/Akt通路相關(guān)。本文通過對EndoA2調(diào)節(jié)PTEN/Akt通路抗心肌急性缺血損傷的機(jī)制研究，為改善AMI后心肌重構(gòu)提供新的治療策略。