崔桂玉 白劍 苗蘭英 林大勇 劉鴻

1內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院（內(nèi)蒙古通遼028000）；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（沈陽 110847）

胎盤間充質(zhì)干細胞是成體干細胞的一種，由于其具有低免疫原性、來源廣泛和免疫抑制的特點，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療缺血性疾病和預(yù)防移植物抗宿主病等［1-2]。由于體內(nèi)免疫系統(tǒng)存在使得外源性輸入的胎盤間充質(zhì)干細胞很快的被淋巴細胞識別、殺傷，這些因素直接導(dǎo)致胎盤間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)存活的時間和數(shù)量減少［3]。人類白細胞抗原-G（human leucocyte antigen-G，HLA-G）屬于非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，在孕婦體內(nèi)表達較高，其主要功能是誘導(dǎo)母嬰耐受，近年來的研究表明HLA-G對于自然殺傷淋巴細胞（natural killer lymphocyte，NK）、CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞具有抑制作用［4-5]。HLA-G可以直接與NK與KIR2DL4受體相互作用，阻斷MAPK和DNA-PKcs信號通路，抑制NK殺傷活性［6]。胎盤間充質(zhì)干細胞能夠表達HLA-G，孕酮可以調(diào)節(jié)HLA-G表達強度，在一定程度上增強胎盤間充質(zhì)干細胞的免疫抑制功能，但是HLA-G表達與孕酮的濃度呈現(xiàn)計量依賴性，當(dāng)孕酮消失后HLA-G表也隨之降低并逐步消失［4，7]。外源性的轉(zhuǎn)染 HLA-G 基因可以持續(xù)的表達該蛋白，有效的增強胎盤間充質(zhì)干細胞的免疫抑制功能，將HLA-G陽性的胎盤間充質(zhì)干細胞與NK細胞混合培養(yǎng)，檢測NK細胞對HLA-G陽性的胎盤間充質(zhì)干細胞殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料NK92mi細胞株和NK92mi培養(yǎng)基（北京鼎國昌盛生物科技有限公司）；DMEM/DF12培養(yǎng)基和PBS（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司）；單克隆抗體CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC（美國BD公司）；PEGFP-N1-HLA-G全基因合成質(zhì)粒（北京奧科鼎盛生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；HLA-G特異性單抗4H84和α-Tublin（Santa Cruz公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；0.25%胰酶（美國Sigma公司）；550酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置（美國Bio-Rad公司）。

足月新生兒胎盤取自于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，取得父母知情同意書后，經(jīng)本院倫理委員會討論通過用以制備胎盤間充質(zhì)干細胞。

1.2 方法

1.2.1 胎盤間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定將胎盤表面用75%的酒精消毒后，并用生理鹽水反復(fù)沖洗3次。將胎盤在超凈工作臺中用眼科剪刀將胎盤剪成大小約為1～2 mm2的碎塊，放入50 mL的離心管中，用生理鹽水沖洗后離心直至離心管中的生理鹽水澄清為止。經(jīng)過在1 500 r/min離心5 min后棄去上清液，加入含0.25%胰酶和0.1膠原酶Ⅳ的生理鹽水30 mL并放置于培養(yǎng)箱中30 min，使得酶在37℃能夠充分的發(fā)揮活性。用100目的濾網(wǎng)過濾胎盤碎塊，將過濾液體放入15 mL離心管中收集，并在1 500 r/min離心5 min后棄去生理鹽水，在離心后的細胞沉淀中加入10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基充分混勻并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。待細胞貼壁后生長至融合度90%左右時用0.25%的胰酶將細胞消化按照1∶3接種于新的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)傳代后的細胞進入指數(shù)生長期后，將細胞消化制備單細胞懸液并調(diào)整濃度至1×106個/mL，取200μL細胞懸液，分別加入CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC流式抗體各5μL，避光室溫孵育20 min后流式細胞儀上檢測。

1.2.2 胎盤間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染HLA-G基因及鑒定將指數(shù)生長期的胎盤間充質(zhì)干細胞2×105個接種到6孔板內(nèi)，加入10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基3 mL，待細胞融合度達到80%左右進行轉(zhuǎn)染。分別取LipofectamineTM2000試劑1.5μL與PEGFP-N1-HLA-G及空載體PEGFP-N1各0.5μg用DMEM/F12稀釋到200μL，將混合后的LipofectamineTM2000室溫放置30 min。棄去6孔板內(nèi)含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基并用PBS沖洗細胞2次，并在每一孔中加入1 000μL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，之后將200μL混有PEGFP-N1-HLA-G及空載體PEGFP-N1的LipofectamineTM2000的DMEM/F12分別滴入6孔板內(nèi)，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基3 mL在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

收集6孔板中轉(zhuǎn)染后的胎盤間充質(zhì)干細胞，通過蛋白裂解液裂解后，收集到1.5 mL EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心1 min，棄上清備用。BCA法進行蛋白定量，向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。加入HLA-G（1∶1 000）和α-Tublin（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜后，加入二抗37℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測各條帶的吸光度值并計算蛋白的相對表達量。

1.2.3 NK細胞殺傷性實驗將胎盤間充質(zhì)干細胞、轉(zhuǎn)染空載體PEGFP-N1的胎盤間充質(zhì)干細胞及轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質(zhì)干細胞計數(shù)，按照每孔1 000個細胞接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，待細胞貼壁后吸取上清液，按照NK-92mi細胞與實驗效應(yīng)細胞10∶1的比例在96孔板內(nèi)的每一個孔中加入10 000個NK-92mi，并混合培養(yǎng)4 h。同時設(shè)置一組無細胞的上清液組作為空白對照組，用于計算細胞的殺傷率。按照CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書進行，將培養(yǎng)基與細胞裂解液體積比10∶1加入上述96孔板中，在重力加速度為250×g情況下離心4 min，取出CytoTox 96的每一孔中加入50μL裂解后的上清液，室溫下靜置避光30 min，后加入終止液，用酶標(biāo)儀在490 nm波段檢測光密度值。細胞的溶解率計算公式為溶解率=（對照組光密度值-實驗組光密度值-空白對照組光密度值）/（對照組光密度值-空白對照組光密度值）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.5統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，組間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤間充質(zhì)干細胞的表面分子的鑒定第二代胎盤間充質(zhì)干細胞通過流式細胞檢測干細胞標(biāo)記物，其中CD45、CD34和HLA-DR呈陰性表達，CD29、CD44和CD105呈陽性表達。其中CD29陽性表達率為98.1%，CD44陽性表達率為99.3%，CD105陽性表達率為98.9%（圖1）。

圖1 胎盤間充質(zhì)干細胞表面受體表達Fig.1 Receptor expression on placenta-derived mesenchymal stem cells

2.2 胎盤間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染HLA-G基因的鑒定空白對照組中HLA-G蛋白的相對表達量為PEGFP-N1-HLA-G轉(zhuǎn)染組的（0.23±0.05）倍，空白對照組與PEGFP-N1-HLA-G組相比結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；PEGFP-N1轉(zhuǎn)染組中HLA-G蛋白的相對表達量為PEGFP-N1-HLA-G轉(zhuǎn)染組的（0.27± 0.03）倍，PEGFP-N1轉(zhuǎn)染組與PEGFP-N1-HLA-G組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3 NK細胞殺傷性實驗經(jīng)過試劑盒檢測后，胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞溶解率（67.53±3.57）%，轉(zhuǎn)染空載體PEGFP-N1的胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞溶解率（69.13±4.11）%，轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞溶解率（51.22±3.87）%，轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質(zhì)干細胞組與胎盤間充質(zhì)干細胞組相比差異有顯著性（P＜0.05、圖3）。

3 討論

圖2 對照組、PEGFP-N1組和PEGFP-N1-HLA-G組中HLAG表達Fig.2 HLA-Gexpression on placenta-derived mesenchymal stem cells in control group，PEGFP-N1group，PEGFP-N1-HLA-Ggroup

圖3 對照組、PEGFP-N1組和PEGFP-N1-HLA-G組中細胞的溶解率Fig.3 Dissolution rate of cells in control group，PEGFP-N1 group，PEGFP-N1-HLA-Ggroup

胎盤間充質(zhì)干細胞容易獲得，且增殖速度快，免疫原性低，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于移植排斥和自身免疫性疾病，是目前最具前景的間充質(zhì)干細胞之一。胎盤間充質(zhì)干細胞存活率是影響其應(yīng)用的重要因素之一，目前對胎盤間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)的清除過程仍然不明，可能與宿主對外源性細胞的清楚和胎盤間充質(zhì)干細胞代謝周期有關(guān)。HLA-G是具有免疫抑制功能的蛋白，在器官移植受者體內(nèi)和孕婦體內(nèi)均能檢出，HLA-G的表達使得胎盤間充質(zhì)干細胞增強免疫抑制功能，并通過抑制NK細胞表面受體KIR2DL4增加在在受者體內(nèi)的存活時間和數(shù)量。有研究顯示，HLA-G可以通過孕酮的調(diào)節(jié)增強胎盤間充質(zhì)干細胞表面的表達，并且與孕酮的濃度呈現(xiàn)計量依賴性，當(dāng)孕酮消失后HLA-G表也隨之降低并逐步消失［8-10]。通過轉(zhuǎn)染的方式可以使得胎盤間充質(zhì)干細胞獲得持續(xù)高表達的HLA-G，從而增強HLA-G陽性的胎盤間充質(zhì)干細胞的免疫抑制功能［4]。

目前，胎盤間充質(zhì)干細胞在臨床的治療以雙向免疫調(diào)節(jié)為主，即存在免疫增強作用也存在著免疫抑制作用，因此在自身免疫病、缺血性疾病、器官移植等多個領(lǐng)域均有應(yīng)用［11]。如果有效增強胎盤間充質(zhì)干細胞在受者體內(nèi)的存活數(shù)量和時間，就可以增強胎盤間充質(zhì)干細胞在受者體的功能。因此本次實驗在此基礎(chǔ)上，通過外源性的對胎盤間充質(zhì)干細胞修飾HLA-G蛋白，檢測HLA-G陽性的胎盤間充質(zhì)干細胞是否可以逃避NK細胞的殺傷。結(jié)果表明，胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞溶解率（67.53±3.57）%而轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞溶解率（51.22±3.87）%，這提示HLA-G抗原可作為免疫耐受分子，直接參與抑制NK細胞的免疫功能，對于提高胎盤間充質(zhì)干細胞存活率有明確作用。但本實驗?zāi)壳皟H局限于體外實驗，體內(nèi)試驗是否有類似的結(jié)果仍然待于進一步觀察。