許銀輝 賴麒 張小影 陳強(qiáng) 唐亮 劉棟 杜振宗

桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胸心外科（廣西桂林 541199）

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的核心組成部分，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）是細(xì)胞生長過程中的重要組成酶之一，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及凋亡密切相關(guān)［1]。5-氮雜胞（5-Aza-dC）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，在口腔癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等［2-4]的表觀治療中可使p16、MGMT和PTEN等抑癌基因高甲基化逆轉(zhuǎn)而得以正常表達(dá)。RASSFA基因在正常肺細(xì)胞中有表達(dá)，在肺癌細(xì)胞株中存在高甲基化率，將該基因去甲基化的A549細(xì)胞株接種于裸鼠后其腫瘤生長明顯縮?。?]；APC基因蛋白調(diào)節(jié)β-catenin蛋白胞質(zhì)內(nèi)降解，是Wnt信號(hào)通路的組成部分，其失活后能激活cmyc、CyclinD1等成瘤基因［6]。然而，有關(guān)5-Aza-dC治療后，DNMT1、RASSF1A和APC基因甲基化在肺癌細(xì)胞株中的改變情況報(bào)道尚少。基于此，本研究選取臨床標(biāo)本驗(yàn)證DNMT1在體內(nèi)的表達(dá)，并運(yùn)用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H358和正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B，通過5-氮雜胞處理后，觀察其生長、侵襲和凋亡的變化，檢測(cè)RASSFA、APC和DNMT1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，來進(jìn)一步探討3種基因改變特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞株A549、H358、BEAS-2B購于南京科佰生物科技有限公司（上海）；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、10%胎牛血清購于美國強(qiáng)生公司，Hoechst 33342、5-氮雜胞苷采自美國Sigma-Aldrich公司；抗DNMT1、RASSFA，、APC和GAPDH抗體購買于賽信通（上海）生物試劑有限公司；AmpliTaq Gold?購自北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司；TBST、PBS試劑購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購買于康寧（中國）有限公司；熒光顯微鏡（奧林巴斯IX71，日本奧林巴斯公司）；流式細(xì)胞儀購買于美國BD公司；RT-PCR試劑盒購買于北京嘉美紐諾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)3種細(xì)胞株先經(jīng)復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的無菌瓶中，后放置于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液及加藥1次，處理生長至80%時(shí)的細(xì)胞以0.1%的胰蛋白酶消化，收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞繼續(xù)傳代或提取蛋白。

1.2.2 赫斯特染色熒光顯微鏡觀察A549和H358細(xì)胞系用5-氮雜胞苷處理后培養(yǎng)在37℃的培養(yǎng)箱中24和48 h，后用0.1μg/mL Hoechst 33342（激發(fā)波長365 nm）加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，染色DNA后室溫放置3～5 min，吸去染液，用TBST和PBS洗滌2～3次，每次3～5 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，熒光顯微鏡檢測(cè)會(huì)看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染的變化。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡處理后的細(xì)胞株A549和H358用PBS緩沖液收集和懸浮，通過抗溴脫氧尿嘧啶核苷的單克隆抗體對(duì)DNA進(jìn)行染色。離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBS洗細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷的70%乙醇，于4℃固定過夜，細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用1 mL PBS洗細(xì)胞一次，加入500μL PBS重懸，4℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞株凋亡率，結(jié)果用軟件Modfit分析。

1.2.4 Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用8 μmol/L孔徑的transwell小室檢測(cè)A539和H358細(xì)胞的遷移能力：在transwell下層小室中加入500 μL含10%的DMEM培養(yǎng)基作為趨化劑，然后向上室加入200μL含6×104細(xì)胞于1%FBS的1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后用棉簽擦拭去除transwell上層小室尚未遷移的細(xì)胞。將小室下層中的細(xì)胞用結(jié)晶紫固定并于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。隨機(jī)取4個(gè)不同鏡下視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)DNMT1蛋白的表達(dá)上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)A549、H358和BEAS-2B細(xì)胞貼壁生長到匯合率達(dá)80%，選擇生長形態(tài)好貼壁牢固的細(xì)胞進(jìn)行傳代，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)；3 d傳代1次，最終收集細(xì)胞。用蛋白裂解液提取蛋白上清液后，分別收集各組蛋白，以BCA法蛋白定量，獲取所得25μg蛋白與5×蛋白上樣緩沖液按照體積4∶1混合，煮沸8 min致變性，后SDS-PAGE電泳，利用PVDF膜濕轉(zhuǎn)250 mA、120 min，密閉1 h，TBST洗膜，加入DNMT1抗體，溫度設(shè)置4℃靜置過夜，后用二抗常溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL熒光顯色后暗室曝光洗片，用Lab Works軟件進(jìn)行灰度分析，記錄結(jié)果。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)DNMT1、RASSFA和APC基因轉(zhuǎn)錄的mRNAA549、H358和BEAS-2B分別用5-氮雜胞苷（3μmol/L）處理24和48 h，收集前后的各組細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：5×reaction buffer 4 μL（Mg2＋10 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）2 μL、Oligo dT 1 μL、RNAse Inhibitor 1 μL、DTT（0.1 mol/L）2μL、總RNA 3μL和M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1μL，DEPCtreated water 6μL；混勻后37℃水浴60 min，然后72℃水浴15 min，4℃暫存10 min，合成的cDNA存放-20℃冰箱備用。RT-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×SYBR Premix ExTaq TM 12.5μL，四基因（GAPDH為內(nèi)參照）上、下游引物（10 pmol/L）各1 μL、cDNA 1μL和ddH2O 6.5μL，反應(yīng)條件為95℃變性45 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)。取3次實(shí)驗(yàn)均值。采用2-ΔΔCT法分析RASSFA、APC和DNMT1基因mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)情況，引物序列見表1。非小細(xì)胞肺癌和非癌組織RNA的提取遵循無酶原則，分別取約80 mg癌和非癌組織，加入Trizol液勻漿，加入0.2 mL的氯仿分離，離心后取上層水相，后加入預(yù)冷75%無酶乙醇洗脫，再溶解提純，行RT-PCR檢測(cè)DNMT1的mRNA的量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件用于統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007登記。數(shù)據(jù)結(jié)果采用非配對(duì)t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)去比較兩組數(shù)據(jù)，多組比較用單向方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

表1 引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 5-氮胞苷處理后，A549、H358細(xì)胞株的生長、侵襲和凋亡通過直方圖，A549和H358表觀治療24和48 h后細(xì)胞增殖能力下降明顯，隨著時(shí)間延長，細(xì)胞阻滯數(shù)目越多（圖1A）；赫斯特染色實(shí)驗(yàn)組的兩細(xì)胞株胞漿濃縮，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞數(shù)目減少，凋亡增加；Transwell方法發(fā)現(xiàn)A549和H358細(xì)胞株進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)目隨著時(shí)間減少（圖1B、1C），結(jié)果表明5-氮雜胞苷是能夠有效地抑制肺癌A549和H358細(xì)胞株的生長、侵襲和凋亡，隨著時(shí)延長，抑制作用越明顯。

圖1 A549、H358細(xì)胞株的生長、侵襲和凋亡情況Fig.1 Growth、invasion and apoptosis of A549 and H358 cell lines

2.2 臨床標(biāo)本和細(xì)胞株相關(guān)基因的表達(dá)收集桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診為非小細(xì)胞肺癌的20例標(biāo)本行RT-PCR分析，DNMT1在非小細(xì)胞肺癌中比相應(yīng)的非癌組織中mRNA轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)（圖2A）；在A549、H358和BEAS-2B細(xì)胞株中，DNMT1在mRNA和蛋白水平均有較高的表達(dá)，并且A549的表達(dá)量（3.54±0.46）要比H358（3.02±0.20）高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B、2C）；經(jīng)過5-氮雜胞苷處理24和48 h后的A549、H358細(xì)胞株中DNMT1的表達(dá)能夠明顯被削弱，RASSFA和APC基因表達(dá)量在A549和H358中作用24和48 h分別為（1.002 ± 0.080）、（2.226 ± 0.132），（1.002 ±0.073）、（2.491 ± 0.063）和（1.000 ± 0.035）、（2.12 ±0.039），（1.001 ± 0.67）、（2.124 ± 0.086）。RASSFA和APC基因在兩細(xì)胞株中能夠隨著時(shí)間延長而表達(dá)增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析RASSFA基因在A549細(xì)胞株中表達(dá)較高，APC基因在H358細(xì)胞株中表達(dá)較高，A549蛋白表達(dá)較H358表達(dá)高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2D、2E、2F）。結(jié)果表明DNMT1抑制劑5-氮雜胞苷能夠抑制DNMT1基因而使腫瘤抑制基因RASSFA和APC重新表達(dá)，與細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果吻合，印證5-氮雜胞苷抑制細(xì)胞功能過程中，有RASSFA、APC基因上調(diào)和DNMT1基因下調(diào)有關(guān)。

圖2 DNMT1、RASSFA、APC基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況Fig.2 Transcription and expression of DNMT1，RASSFA and APCGenes

3 討論

DNMT1甲基化轉(zhuǎn)移酶定位于染色體19p13.3-p13.2，擁有1 620個(gè)氨基酸，其cDNA全長5 434個(gè)堿基對(duì)，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量最多的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，其在腫瘤細(xì)胞中活性較其他轉(zhuǎn)移酶高。文獻(xiàn)［7-8]表明，DNMT1在胃癌、胰腺癌、口腔癌、卵巢癌和喉癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，表達(dá)增加的DNMT1作用于抑癌基因的CpG島使其DNA甲基化異常增加，使得抑癌基因得不到正常表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞增殖。抑癌基因甲基化程度從正常肺組織到癌前病變?cè)俚椒伟┏拭黠@增加的趨勢(shì)，某些基因的高甲基化可能使腫瘤細(xì)胞具有易于轉(zhuǎn)移的潛能。ZHANG等［9]進(jìn)行的一項(xiàng)針對(duì)肺癌患者20個(gè)抑癌基因甲基化狀態(tài)的研究結(jié)果顯示，APC、RASSFA、SFRP1、RARβ和P16基因在癌組織中明顯高甲基化，甲基化的程度與病情的發(fā)展、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究采取臨床標(biāo)本行RT-PCR結(jié)果表明DNMT1在肺癌組織中與其他腫瘤研究一樣呈現(xiàn)高表達(dá)；DNMT1基因轉(zhuǎn)錄蛋白在肺癌A549和H358細(xì)胞株的表達(dá)明顯高于正常上皮細(xì)胞的表達(dá)，表明DNMT1是促癌基因，甲基化程度較低。給予甲基化抑制劑5-氮雜胞苷后，RASSFA和APC基因蛋白表達(dá)明顯增加，與時(shí)間呈正比，導(dǎo)致兩肺癌細(xì)胞株細(xì)胞功能降低。這預(yù)示著5-氮雜胞苷能使抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)去甲基化，恢復(fù)抑癌基因的正常表達(dá)，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的自殺負(fù)調(diào)控機(jī)制。因此，去除腫瘤抑制基因的高甲基化狀態(tài)，有利于恢復(fù)腫瘤抑癌基因。

DNMT1抑制劑5-氮雜胞苷能夠通過使腫瘤抑制基因去甲基化而抑制癌基因翻譯和轉(zhuǎn)錄，從而阻止腫瘤生長和侵襲。在兩組細(xì)胞株A549和H838中，劉邦卿等［10]研究得出通過5-氮雜胞處理后，DNMT1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，但其變化是否對(duì)相關(guān)抑癌基因甲基化改變和表達(dá)無進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明A549和H358中DNMT1活性降低，RASSFA和APC基因能夠重新表達(dá)，并且A549中RASSFA較明顯，H358中APC較明顯，同時(shí)A549的表達(dá)量要比H358高，該研究彌補(bǔ)了其實(shí)驗(yàn)無深入研究的不足。因此，DNMT1可以作為非小細(xì)胞肺癌表觀治療的預(yù)后標(biāo)記物。綦曉艷等［11]研究得出5-氮雜胞苷可以逆轉(zhuǎn)DR4基因甲基化狀態(tài)，促使肺癌細(xì)胞的凋亡，我們實(shí)驗(yàn)表明5-氮胞苷沉默DNMT1后也能抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)A549和H358細(xì)胞凋亡，或許與5-氮雜胞苷逆轉(zhuǎn)RASSFA和APC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)有關(guān)。不過，目前有關(guān)5-氮雜胞苷在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制尚不完全明確，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其能夠使A549和H358生長及侵襲力減弱，并促進(jìn)凋亡。

綜上所述，肺癌組織中DNMT1基因高表達(dá)，表觀治療可使肺癌A549和H358細(xì)胞株中DNMT1基因表達(dá)降低，在前人基礎(chǔ)上得出抑癌基因RASSFA和APC表達(dá)升高，導(dǎo)致癌細(xì)胞功能下降，可能預(yù)示5-氮雜胞苷能夠誘導(dǎo)RASSFA和APC啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化，從而抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖、生長和侵襲。不過，5-氮雜胞苷抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)制能否引起癌基因甲基化增加，仍需進(jìn)一步研究。另外，本研究只是進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的有力支持，下一步值得探討5-氮雜胞苷對(duì)肺癌動(dòng)物模型的作用效果，以及5-氮雜胞苷聯(lián)合其他抗腫瘤藥物治療的有效性。