胡喆皓 上官紫微 邱建榕 楊珊珊 鮑文 沈毅 李鵬 丁志華

(浙江大學(xué)光電科學(xué)與工程學(xué)院,現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310027)(2017年7月28日收到;2018年5月24日收到修改稿)

1 引 言

光學(xué)相干層析成像(OCT)技術(shù)[1?3]作為一種非接觸、無損傷的光學(xué)成像手段,針對(duì)活體生物組織的成像,可實(shí)現(xiàn)微米量級(jí)的成像分辨率和1—3 mm的成像深度,目前已在眼科、皮膚科、心血管等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[4?16].隨著醫(yī)療水平的不斷提高,人們?cè)絹碓疥P(guān)注疾病的早期診斷與治療.傳統(tǒng)OCT技術(shù)成像對(duì)比源于組織折射率波動(dòng)導(dǎo)致的后向散射光的差異,但不同生理病理狀態(tài)下組織復(fù)折射率實(shí)部的變化不大,因此,現(xiàn)行OCT技術(shù)在分子特異性識(shí)別能力上存在先天不足[17?21].鑒于特定分子及其分布與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性,如果將分子光譜技術(shù)與傳統(tǒng)OCT技術(shù)有機(jī)結(jié)合,拓展OCT的分子識(shí)別功能,將具有重要的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值,不僅能實(shí)現(xiàn)微米量級(jí)高分辨率結(jié)構(gòu)成像,而且能獲取生理病理關(guān)聯(lián)分子的空間分布信息(關(guān)聯(lián)分子空間分布的分辨率仍在微米量級(jí)),這對(duì)于生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像技術(shù)而言,無疑是一個(gè)重要的飛躍.需要指出的是,拓展OCT的分子識(shí)別功能,并不意味著OCT系統(tǒng)的空間分辨率能達(dá)到分子尺度,而是指OCT成像信號(hào)與特定分子存在特異性關(guān)聯(lián)[22].

目前,基于熒光信號(hào)探測(cè)的熒光顯微成像是實(shí)現(xiàn)特異性分子成像的重要途徑.然而,熒光信號(hào)屬于非相干信號(hào),無法滿足OCT成像對(duì)信號(hào)光的相干性要求,因而無法用于OCT成像.基于相干光的分子瞬態(tài)吸收或熱效應(yīng),采用雙光源和單光源外加倍頻的抽運(yùn)探測(cè)方法,Desmond等[20]實(shí)現(xiàn)了黑色素的分子OCT成像,Kim和Applegate[21]實(shí)現(xiàn)了亞甲藍(lán)染料的分子OCT成像.Min等[23]首次將受激輻射信號(hào)用于分子成像,但主要目的是解決非熒光色團(tuán)極其微弱的自發(fā)輻射熒光成像難題,并非用于OCT成像.不同于熒光信號(hào),受激輻射信號(hào)是相干信號(hào),可以在OCT中加以利用.

為此,本文提出基于受激輻射信號(hào)來拓展OCT的分子特異性,采用的分子特異性關(guān)聯(lián)信號(hào)是分子的受激輻射信號(hào).選用傳統(tǒng)OCT中比較典型的超連續(xù)譜光源,通過增設(shè)光譜分光與調(diào)制抽運(yùn)光支路,建立了基于單寬譜光源的抽運(yùn)探測(cè)譜域OCT系統(tǒng),發(fā)展了基于受激輻射信號(hào)的分子OCT成像方法.與以往報(bào)道過的采用兩個(gè)獨(dú)立光源分別負(fù)責(zé)抽運(yùn)和探測(cè)、且兩個(gè)光源之間需要嚴(yán)格同步控制的抽運(yùn)探測(cè)方案相比,本系統(tǒng)只需單一寬光譜光源,基于單一光源中的不同光譜段分別用于抽運(yùn)和探測(cè),不需要額外的同步裝置,因而具有明顯的成本和控制優(yōu)勢(shì).

2 方 法

圖1所示為基于受激輻射信號(hào)的譜域OCT系統(tǒng)示意圖,它在已建立的超高分辨率譜域OCT系統(tǒng)[11]基礎(chǔ)上,增設(shè)了調(diào)制抽運(yùn)光支路.由超連續(xù)譜激光器(SC450,美國(guó)Fianium公司)發(fā)出的光,經(jīng)擴(kuò)束后通過截止濾光片(截止800 nm以上的光譜)分離出光譜范圍為450—800 nm的寬帶光譜光.該寬帶光譜光抵達(dá)二向色鏡后,分成反射和透射兩路光.反射光路為調(diào)制抽運(yùn)光支路,其光譜范圍為480 nm±30 nm,該支路中設(shè)置了光學(xué)斬波器(optical chopper,美國(guó)Thorlabs公司),用于對(duì)抽運(yùn)光的強(qiáng)度調(diào)制.透射支路為探測(cè)光支路,其光譜范圍為520—800 nm,該支路中設(shè)置了可調(diào)量程為10 cm的光學(xué)延遲線(對(duì)應(yīng)的最大時(shí)間延遲約為300 ps).兩支路光經(jīng)過第二個(gè)二向色鏡后匯合,并經(jīng)分光鏡分為參考光和樣品光.抽運(yùn)光與探測(cè)光同時(shí)抵達(dá)樣品,光脈沖間的時(shí)序圖如圖2所示.鑒于抽運(yùn)光與探測(cè)光源于同一超連續(xù)譜激光器,抽運(yùn)光與探測(cè)光的光脈沖間隔及光脈沖寬度均相同,分別為50 ns(對(duì)應(yīng)于重復(fù)頻率20 MHz)和20 ps.抽運(yùn)光脈沖與探測(cè)光脈沖的時(shí)域同步及相對(duì)時(shí)延,通過光學(xué)延遲線來控制,最大可調(diào)量程約為300 ps.從參考臂和樣品臂返回的光在分束鏡處匯合并發(fā)生干涉,通過另一截止濾光片(截止抽運(yùn)光)后進(jìn)入光譜儀.在光譜儀中,干涉光經(jīng)衍射光柵分光,不同的光譜成分被透鏡聚焦到線陣CCD(中心波長(zhǎng)為600 nm,1200 lines/mm,美國(guó)Thorlabs公司)分光,并由線陣CCD采集.

圖1 基于受激輻射信號(hào)的譜域OCT系統(tǒng)Fig.1.Schematic diagram of the stimulated-emission based spectral domain optical coherence tomography system.

圖2 抽運(yùn)光脈沖和探測(cè)光脈沖間的同步示意圖Fig.2.Pulses synchronization between pump beam and probe beam.

圖3 調(diào)制抽運(yùn)探測(cè)時(shí)序圖 (a)光學(xué)斬波器方波調(diào)制信號(hào);(b)調(diào)制抽運(yùn)光脈沖信號(hào);(c)傳統(tǒng)探測(cè)光脈沖信號(hào);(d)受激輻射探測(cè)光脈沖信號(hào);(e)線陣CCD采樣信號(hào)Fig.3.Time sequence of the modulated pump-probe detection:(a)Squarewave modulation of the optical chopper;(b)modulated pulses of the pump beam;(c)unmodulated pulses of the input probe beam;(d)stimulated-emission pulses of the output probe beam;(e)sampling sequence of the CCD.

為實(shí)現(xiàn)受激輻射信號(hào)的高靈敏度提取,采用調(diào)制抽運(yùn)探測(cè)方案,其時(shí)序如圖3所示.光學(xué)斬波器對(duì)抽運(yùn)光脈沖序列進(jìn)行了調(diào)制頻率為2.5 kHz的強(qiáng)度調(diào)制,該調(diào)制周期對(duì)應(yīng)8000個(gè)探測(cè)光脈沖周期.受激輻射后的探測(cè)光脈沖幅度較之傳統(tǒng)的探測(cè)光脈沖呈現(xiàn)出微小增量.線陣CCD采樣頻率為25 kHz,是抽運(yùn)光調(diào)制頻率的10倍,因此,對(duì)應(yīng)于1個(gè)光學(xué)斬波器的調(diào)制周期,有10個(gè)CCD采樣周期.

如果暫不考慮受激輻射信號(hào)的貢獻(xiàn),抵達(dá)CCD探測(cè)面的干涉信號(hào)可表示為

式中k=2π/λ代表波數(shù),ρ表示CCD的響應(yīng)度(單位A/W),S(k)為探測(cè)光的功率譜,rR為參考臂中反射鏡的反射系數(shù),zR為以分光鏡為坐標(biāo)原點(diǎn)的參考臂反射鏡距離,rS(z)為樣品中軸向分布的后向反射系數(shù)(與傳統(tǒng)OCT信號(hào)相對(duì)應(yīng)),z為以分光鏡為坐標(biāo)原點(diǎn)樣品中后向散射點(diǎn)的距離.不失一般性,將坐標(biāo)原點(diǎn)設(shè)在參考反射鏡上,即zR=0,并假定rR=1,則(1)式簡(jiǎn)化為

事實(shí)上,本系統(tǒng)中來自樣品的后向反射信號(hào)應(yīng)該分為兩個(gè)部分.其一是對(duì)應(yīng)于傳統(tǒng)散射對(duì)比機(jī)制的后向反射光,其二是對(duì)應(yīng)于分子對(duì)比機(jī)制的受激輻射后向反射光.在抽運(yùn)光的作用下,樣品中發(fā)色團(tuán)被激勵(lì)到激發(fā)態(tài)后,在探測(cè)光的誘導(dǎo)下會(huì)產(chǎn)生與探測(cè)光傳播方向、相位及偏振態(tài)完全一致的受激輻射光,共同參與探測(cè)光的相干干涉.在非飽和條件下,受激輻射信號(hào)強(qiáng)度與抽運(yùn)光光強(qiáng)、探測(cè)光幅值及發(fā)色團(tuán)分子數(shù)成正比[24],即

式中Ipump,Iprobe,c(z)分別為抽運(yùn)光的光強(qiáng)、探測(cè)光的光強(qiáng)、樣品中發(fā)色團(tuán)分子數(shù)的軸向分布.因此,與上述兩部分返回光相對(duì)應(yīng)的干涉光譜信號(hào)可分別寫為:

這里,η為受激輻射光子的產(chǎn)生效率m(t)為光學(xué)斬波器的調(diào)制信號(hào),t代表時(shí)間.(4)式與(5)式分別代表了傳統(tǒng)OCT信號(hào)和受激輻射OCT信號(hào).至此,線陣CCD采集到的干涉光譜信號(hào)可表示為

這里,mCCD(t)為線陣CCD的采樣函數(shù),ID(k,t)為抵達(dá)CCD探測(cè)面的總干涉光譜信號(hào).不失一般性,假定光學(xué)斬波器的調(diào)制信號(hào)和線陣CCD采樣函數(shù)均可由方波函數(shù)來表征,對(duì)應(yīng)于光學(xué)斬波器調(diào)制頻率(ωm)一個(gè)調(diào)制周期Tm,調(diào)制信號(hào)和采樣函數(shù)分別表示為:

這里已根據(jù)系統(tǒng)條件,將線陣CCD采樣頻率10倍于光學(xué)斬波器調(diào)制頻率的因數(shù)考慮在內(nèi).

利用(7)式和(8)式,并對(duì)(6)式依次在k域做傅里葉逆變換,在t域做傅里葉變換,得到對(duì)應(yīng)于干涉光譜采集信號(hào)的頻譜M(z,ω),表示為式中γ(z)為光源功率譜S(k)的傅里葉逆變換表征,OCT系統(tǒng)的軸向分辨率k1和k2為周期方波信號(hào)在t域上做傅里葉變換所得結(jié)果的級(jí)數(shù),AC和AC′均表示自相關(guān)項(xiàng),I=η·Ipump為受激輻射效率和抽運(yùn)光強(qiáng)的乘積.(9)式所表示的頻譜中,處于調(diào)制頻率ωm處的信號(hào)對(duì)應(yīng)于受激輻射信號(hào),而在零頻處的信號(hào)可作為傳統(tǒng)OCT信號(hào).為此,在調(diào)制頻率ωm處設(shè)置寬度為25 Hz的提取窗口并在頻率域沿窗口積分,可得受激輻射OCT的一個(gè)軸向分布(A-line)Ppp(z),其表達(dá)式為

類似傳統(tǒng)OCT的處理方法,對(duì)應(yīng)于c(z)的信號(hào)可從(10)式中分離出來,即

由(11)式可知,受激輻射OCT信號(hào)與抽運(yùn)光功率Ppump、樣品中發(fā)色團(tuán)分子數(shù)軸向分布c(z)、樣品中后向反射系數(shù)rs(z)和探測(cè)光功率(包含在光源功率譜S(k)中)成正比.其中,抽運(yùn)光功率Ppump和探測(cè)光功率在局部區(qū)域可近似為常數(shù).因此,受激輻射OCT信號(hào)可以看作是反射系數(shù)rs(z)和發(fā)色團(tuán)分子數(shù)c(z)的乘積.

同理,傳統(tǒng)OCT的軸向分布(A-line)也可從(9)式中得到,即

對(duì)比(11)式和(12)式可知,受激輻射OCT信號(hào)可以看作是反射系數(shù)rS(z)和發(fā)色團(tuán)分子數(shù)c(z)的乘積;而在(12)式中傳統(tǒng)OCT的軸向分布與樣品的后向反射系數(shù)rS(z)成正比,無法反映發(fā)色團(tuán)分子數(shù)c(z).這也說明了受激輻射OCT技術(shù)是針對(duì)特異性分子成像的一項(xiàng)技術(shù),很好地彌補(bǔ)了OCT技術(shù)無法進(jìn)行分子成像的缺陷.進(jìn)一步,從(11)式和(12)式可知,利用受激輻射OCT信號(hào)和傳統(tǒng)OCT信號(hào)的比值,可以得到發(fā)色團(tuán)分子數(shù)c(z).因此,采用(13)式來表征受激輻射OCT信號(hào),即

3 實(shí) 驗(yàn)

一般而言,生物組織的受激輻射OCT成像,可以基于內(nèi)源性分子,也可基于外源性分子.這里,為了初步驗(yàn)證受激輻射OCT成像技術(shù)的可行性,選取氮化物(Nitride)粉末作為受激輻射分子成像實(shí)驗(yàn)樣品.該樣品的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為440—460 nm,自發(fā)輻射光譜范圍如圖4所示,其峰值波長(zhǎng)為630 nm.因此,該樣品符合本系統(tǒng)所設(shè)計(jì)的抽運(yùn)探測(cè)的光譜要求.

圖4 氮化物的自發(fā)輻射光譜Fig.4.Spontaneous emission spectrum of Nitride.

為驗(yàn)證調(diào)制抽運(yùn)探測(cè)方法的有效性,將氮化物粉末平鋪在厚度為2 mm的載玻片上,并利用上述系統(tǒng)進(jìn)行掃描成像.不同于傳統(tǒng)OCT成像,為實(shí)現(xiàn)微弱受激輻射信號(hào)的探測(cè),需在任意橫向位置處實(shí)施重復(fù)掃描.實(shí)驗(yàn)中選擇的重復(fù)次數(shù)為500.由二維掃描振鏡的技術(shù)參數(shù)可得,本系統(tǒng)在水平方向的成像范圍為1.2 mm,完成樣品重復(fù)采樣所需的掃描時(shí)間約為4 min.典型結(jié)果如圖5所示.圖5(a)為傳統(tǒng)OCT圖像;圖5(b)為圖5(a)中紅色箭頭所指位置處的軸向分布信號(hào),它由干涉光譜采集信號(hào)針對(duì)k域的傅里葉逆變換得到;圖5(c)為500次重復(fù)采樣過程中對(duì)應(yīng)于圖5(b)中紅虛線深度位置的信號(hào)隨時(shí)間變化;針對(duì)圖5(c)的信號(hào)在時(shí)間域做傅里葉變換,可得對(duì)應(yīng)于圖5(b)中紅虛線深度位置處的頻譜,如圖5(d)所示.從圖5(d)中可以發(fā)現(xiàn),在抽運(yùn)調(diào)制頻率(2.5 kHz)處有一尖峰,它由氮化物粉末的受激輻射信導(dǎo)致.

為驗(yàn)證該信號(hào)確實(shí)對(duì)應(yīng)于受激輻射信號(hào),通過抽運(yùn)光的開啟與關(guān)閉方式進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6所示.圖6(a)和圖6(b)分別為抽運(yùn)光開啟與關(guān)閉兩種條件下分光模塊的實(shí)驗(yàn)照片.對(duì)應(yīng)這兩種狀態(tài),特定深度位置處的頻譜如圖6(c)和圖6(d)所示.不難發(fā)現(xiàn),在調(diào)制頻率(2.5 kHz)處,紅箭頭所指的信號(hào)在圖6(c)中出現(xiàn),而在圖6(d)中已消失.因此,圖6(c)中2.5 kHz處的信號(hào)確為受激輻射信號(hào).

需要指出:表面上看,相比于背景噪聲,該信號(hào)的強(qiáng)度并不是很大,但是此信號(hào)對(duì)于OCT技術(shù)而言并不弱.OCT只探測(cè)單次散射光,而濾掉絕大部分的多次散射光,由此來保證軸向分辨率,這是OCT探測(cè)方法本身決定的.但鑒于OCT采用相干探測(cè)方法,其探測(cè)靈敏度一般可達(dá)100 dB,明顯高于常規(guī)的強(qiáng)度探測(cè)技術(shù),因此仍可探測(cè)從樣品深處返回的弱信號(hào).

圖5 抽運(yùn)探測(cè)信號(hào)的處理過程 (a)傳統(tǒng)OCT圖像;(b)圖(a)中紅色箭頭所指位置處的軸向分布信號(hào);(c)圖(b)中紅虛線深度位置處信號(hào)隨時(shí)間的變化;(d)圖(b)中紅虛線深度位置處的頻譜Fig.5.Signal processing procedure of the pump-probe detection:(a)Traditional OCT image;(b)axial distribution at the position indicated by the red arrow in(a);(c)variation of the signal with time at the depth position indicated by the red dotted line in(b);(d)rrequency spectrum at the depth position indicated by the red dotted line in(b).

圖6 抽運(yùn)光開啟與關(guān)閉兩種狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比 (a),(c)抽運(yùn)光開啟;(b),(d)抽運(yùn)光關(guān)閉Fig.6.Comparison of experimental results between switched on and offof the pump beam:(a),(c)Switched on the pump beam;(b),(d)turn offthe pump beam.

圖7 氮化物粉末構(gòu)建樣品成像 (a)傳統(tǒng)OCT圖像;(b)受激輻射OCT圖像Fig.7.Images of samples composed of nitride power:(a)Traditional OCT image;(b)stimulated-emission based OCT image.

圖8 氮化物粉末與瓊脂顆粒構(gòu)建樣品成像 (a)傳統(tǒng)OCT圖像;(b)受激輻射OCT圖像Fig.8.Images of samples composed of nitride powder and agar particles:(a)Traditional OCT image;(b)stimulated-emission based OCT image.

為驗(yàn)證受激輻射成像的可行性,選擇氮化物粉末與蓋玻片來構(gòu)建樣品,并利用上述系統(tǒng)進(jìn)行掃描成像,成像結(jié)果如圖7所示.圖7(a)為傳統(tǒng)OCT圖像;圖7(b)為受激輻射OCT圖像.圖7(a)與圖7(b)對(duì)應(yīng)于氮化物直接放置在厚度為0.17 mm的蓋玻片表面,并使蓋玻片傾斜一定的角度,蓋玻片的左半部分氮化物粉末厚度較大,右半部分氮化物粉末厚度很小.從圖7(b)中可以看到,對(duì)應(yīng)氮化物熒光粉末濃度分布較大的位置的受激輻射信號(hào)較強(qiáng),如圖中藍(lán)色箭頭所指向的位置.圖8所示的成像對(duì)象由氮化物粉末、瓊脂顆粒及蓋玻片構(gòu)成.圖8(a)為傳統(tǒng)OCT圖像,其中兩大顆粒對(duì)應(yīng)的是瓊脂顆粒,兩瓊脂顆粒之間分布了氮化物粉末.從圖8(b)中可以看出,在氮化物粉末區(qū)域(如圖中紅色箭頭位置)有受激輻射信號(hào),而對(duì)應(yīng)于瓊脂顆粒區(qū)域(如圖中藍(lán)色虛線框內(nèi))則基本上可看成是背景信號(hào).對(duì)比圖8(a)和圖8(b)可知,傳統(tǒng)OCT圖像對(duì)樣品中所有的分子都可進(jìn)行成像,無論是可以誘導(dǎo)產(chǎn)生受激輻射效應(yīng)的氮化物熒光粉末,還是不會(huì)產(chǎn)生受激輻射的瓊脂顆粒,都能在傳統(tǒng)OCT圖像上顯示出輪廓與分布信息;相比之下,受激輻射OCT圖像則可以特異性地反映出可誘導(dǎo)產(chǎn)生受激輻射效應(yīng)的氮化物熒光粉末的位置信息,如圖8(b)中信號(hào)較強(qiáng)的位置,而不會(huì)反映不發(fā)生受激輻射效應(yīng)的瓊脂顆粒的位置信息.因此,受激輻射OCT技術(shù)是針對(duì)特異性分子成像的一項(xiàng)技術(shù),很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)OCT技術(shù)無法進(jìn)行分子成像的先天不足.

此外,相比于傳統(tǒng)的熒光顯微成像技術(shù),我們的方法基于受激輻射,受激輻射光與激發(fā)光為同方向的相干光,因此,可以利用低數(shù)值孔徑物鏡收集其后向散射的受激輻射光,采用干涉探測(cè)方法來獲取.而傳統(tǒng)熒光為自發(fā)輻射光,輻射光方向?yàn)橐园l(fā)射體為出發(fā)點(diǎn)的任意方向,通常需要高數(shù)值孔徑的物鏡來高效收集,而且它是非相干光,只能采用強(qiáng)度探測(cè),無法采用OCT方法來探測(cè).這也是至今為止OCT難以實(shí)施分子識(shí)別成像的原因.因此,較之于熒光顯微成像技術(shù),基于受激輻射的OCT技術(shù)在分子成像領(lǐng)域具有優(yōu)勢(shì).

從圖8中可以看出,相比于傳統(tǒng)的OCT的成像結(jié)果,基于受激輻射信號(hào)的圖像的信噪比較低.雖然傳統(tǒng)OCT圖像與受激輻射OCT圖像采用完全不同的對(duì)比機(jī)制,不能直接比較,但是,為進(jìn)一步提高該技術(shù)的可應(yīng)用性,增大分子OCT圖像的對(duì)比度也是亟待解決的重要課題.

4 結(jié) 論

本文提出并發(fā)展了基于受激輻射信號(hào)的分子OCT成像方法.在超高分辨率譜域OCT系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,通過增設(shè)光譜分光與調(diào)制抽運(yùn)光支路,建立了基于單寬譜光源的抽運(yùn)探測(cè)譜域OCT系統(tǒng),發(fā)展了調(diào)制抽運(yùn)下受激輻射OCT信號(hào)與傳統(tǒng)OCT信號(hào)同步獲取的方法.選取氮化物粉末作為分子成像實(shí)驗(yàn)樣品,通過抽運(yùn)光開啟與關(guān)閉的對(duì)照實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了該分子受激輻射信號(hào)相干探測(cè)的可行性.基于研制的抽運(yùn)探測(cè)譜域OCT系統(tǒng)與成像方法,實(shí)現(xiàn)了氮化物粉末構(gòu)建樣品的傳統(tǒng)OCT與分子OCT的同步成像.