劉雄波 林丹櫻 吳茜茜 嚴(yán)偉 羅騰 楊志剛 屈軍樂

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)(2018年2月10日收到;2018年6月4日收到修改稿)

1 引 言

熒光顯微成像技術(shù)可借助熒光標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)對樣品的特異性成像,被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[1,2].熒光具有多個(gè)特征參量,包括光譜、強(qiáng)度、壽命、偏振等,都可用于產(chǎn)生圖像對比度,其中通過測量熒光壽命形成圖像的技術(shù)稱為熒光壽命顯微成像( fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM).FLIM技術(shù)不受激發(fā)光強(qiáng)度、探針濃度、光漂白等因素的影響[3,4],且能區(qū)分熒光光譜非常接近的不同熒光團(tuán)[5?7],因此具有非常好的特異性和很高的靈敏度.此外,由于熒光分子的熒光壽命能十分靈敏地反映激發(fā)態(tài)分子與周圍微環(huán)境的相互作用及能量轉(zhuǎn)移,FLIM技術(shù)常被用來實(shí)現(xiàn)對微環(huán)境中許多生化參量的定量測量,如細(xì)胞中折射率、黏度、溫度、pH值的分布和動(dòng)力學(xué)變化等[4,6,7],這在生物醫(yī)學(xué)研究中具有非常重要的意義.近年來,隨著激光技術(shù)、探測器技術(shù)、超分辨成像等相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展[3,7],同時(shí)結(jié)合算法和熒光探針合成技術(shù)的進(jìn)步,FLIM不僅在技術(shù)上得到了快速發(fā)展,而且被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和納米材料等研究領(lǐng)域.本文介紹基于不同熒光壽命探測方法的FLIM成像技術(shù)的基本原理及特點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上概述該技術(shù)及其應(yīng)用的最新研究進(jìn)展,最后對其發(fā)展前景進(jìn)行展望.

2 FLIM的分類及其特點(diǎn)

如圖1(a)所示,熒光分子受到激發(fā)光激發(fā)后,其電子吸收激發(fā)光光子能量由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài),隨后經(jīng)短暫的振動(dòng)弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換過程后回到基態(tài)并發(fā)出熒光光子.激發(fā)光撤銷后,由于每個(gè)熒光分子處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間長短不一,熒光物質(zhì)作為一個(gè)整體,其熒光強(qiáng)度I呈指數(shù)衰減,當(dāng)熒光強(qiáng)度衰減為初始強(qiáng)度I0的1/e時(shí)所用的時(shí)間稱為熒光壽命τ(同時(shí)存在多個(gè)壽命組分時(shí)用τi表示,如圖1(a)公式所示,其中ai表示各組分的占比),用于表征熒光分子在激發(fā)態(tài)的平均停留時(shí)間,與其由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的退激速率成反比,是熒光分子固有的一個(gè)特征參數(shù),和絕對發(fā)光強(qiáng)度無關(guān).由于熒光分子的退激過程很容易受到周圍微環(huán)境變化的影響,因此通過測量熒光壽命能十分靈敏地對周圍的微環(huán)境變化進(jìn)行監(jiān)測.FLIM技術(shù)根據(jù)壽命獲取方式的不同分為頻域法和時(shí)域法兩類:頻域法利用經(jīng)過調(diào)制的連續(xù)光激發(fā)樣品,通過檢測熒光信號的振幅和相位變化來計(jì)算壽命;時(shí)域法采用高重復(fù)頻率的超短脈沖激光激發(fā)樣品,通過分析脈沖過后的熒光衰減曲線得到壽命信息.在時(shí)域法中,由于目前探測器的響應(yīng)尚不能直接記錄熒光衰減曲線,因此需要采取一些巧妙的間接探測方式,常用的有門控法、條紋相機(jī)法、時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(time-correlated single photon counting,TCSPC)法等[8,9],如圖1(b)—(e)所示.

圖1 熒光壽命基本原理及其測量方法示意圖[8,9] (a)熒光發(fā)射及熒光強(qiáng)度衰減曲線示意圖(單組分、多組分);(b)頻域法;(c)門控法(單組分);(d)條紋相機(jī)法;(e)TCSPC法Fig.1.Basic principle of fluorescence lifetime and schematic diagrams of lifetime measurement methods[8,9]:(a)Schematic diagrams of fluorescence emission and fluorescence intensity decay curves(single component and multicomponent);(b)frequency domain method;(c)gated image method(single component);(d)streak camera method;(e)TCSPC method.

2.1 頻域法

頻域法測量熒光壽命最早是由日本大阪大學(xué)提出的[10],其基本原理是采用強(qiáng)度按正弦調(diào)制的激發(fā)光激發(fā)樣品,產(chǎn)生的熒光信號頻率與激發(fā)光相同,但幅值下降、相位滯后,如圖1(b)所示,可通過兩者的振幅比(M=(b/B)/(a/A))和相位差(Δ?)計(jì)算樣品的熒光壽命(τΔ?=(1/ω)tanΔ?,τM=(1/ω)[1/(M2?1)]1/2,ω為調(diào)制頻率)[4].對于單組分,有τΔ?=τM[6,7].頻域法的優(yōu)點(diǎn)是原理簡單,對設(shè)備要求不高,相比時(shí)域法成本低.但由于熒光壽命一般與調(diào)制頻率成反比,測量不同熒光壽命的樣品需要選擇不同的調(diào)制頻率,因此通常需要采用調(diào)制頻率連續(xù)可調(diào)的激光源.另一方面,頻域法理論上可以分辨多組分樣品的熒光壽命,但實(shí)際操作時(shí)通常需要預(yù)先采用熒光壽命已知的樣品對系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定,才能確保測量的準(zhǔn)確性,同時(shí)還要預(yù)估樣品中熒光組分的數(shù)量,再對各組分逐一進(jìn)行測量,因此測量過程較為復(fù)雜繁瑣,成像速度受到限制.相比采用掃描成像方式的頻域FLIM,寬場頻域FLIM成像速度相對較快,但離焦背景熒光和散射光的影響使得圖像對比度較差,成像深度受限[11].

2.2 門控法

時(shí)域法采用脈沖激光激發(fā)樣品,相比頻域法的高強(qiáng)度連續(xù)激光照射,對樣品的光損傷更小.當(dāng)樣品的熒光強(qiáng)度呈單指數(shù)衰減時(shí),可采用門控法測量其熒光壽命.如圖1(c)所示,門控法的基本原理是采用具有時(shí)間分辨能力的探測器記錄不同“時(shí)間門”處的光強(qiáng)來計(jì)算或擬合壽命.常用的探測器為像增強(qiáng)型電荷耦合器件(intensi fied charge-coupled device).由于門控法采用寬場成像方式,且對于單組分熒光壽命的測量理論上僅需探測兩個(gè)不同時(shí)刻的熒光強(qiáng)度[12],因而門控法FLIM在各種方法中成像速度是最快的.但門控法對系統(tǒng)同步及探測器的靈敏度要求非常高,且通常在單次時(shí)間門內(nèi)光子利用率較低,采集的熒光信號較弱,同時(shí)寬場成像方式由于成像對比度較差,得到的熒光壽命值精度不高[8].此外,在獲取多組分熒光壽命時(shí),門控法需要多個(gè)時(shí)間門,且分析較為復(fù)雜,因此應(yīng)用相對較少.

2.3 條紋相機(jī)法

如圖1(d)所示,條紋相機(jī)法的基本原理是利用條紋相機(jī)(streak camera,也稱掃描相機(jī))中掃描電場的加速使不同時(shí)間到達(dá)的光電子在空間上分開,從而將時(shí)間分布轉(zhuǎn)化為空間分布以獲取熒光衰減信息[13].由于相機(jī)的一個(gè)空間維度被用于顯示時(shí)間分布,因此激發(fā)樣品時(shí)一般需要利用柱透鏡或振鏡的一維掃描對樣品進(jìn)行線照明,再通過垂直方向的掃描實(shí)現(xiàn)二維成像.這種方法的時(shí)間分辨率較高,但動(dòng)態(tài)范圍通常較窄,且由于成像時(shí)需要至少一維掃描,又受到條紋相機(jī)積分時(shí)間及讀出速度等參數(shù)的限制,因而成像速度較慢[5,9].

2.4 TCSPC法

TCSPC法是目前測量熒光壽命時(shí)間分辨率最高、應(yīng)用最廣泛的技術(shù).如圖1(e)所示,TCSPC法的基本原理是記錄激發(fā)脈沖過后首個(gè)熒光光子到達(dá)探測器的時(shí)間并進(jìn)行計(jì)數(shù),多次重復(fù)建立一個(gè)正比于熒光衰減曲線的光子數(shù)-時(shí)間分布直方圖,用于擬合熒光壽命.由于需要探測單光子信號,TCSPC-FLIM一般采用高靈敏度光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)或雪崩光電二極管(avalanche photodiode,APD)作為探測器,因此通常建立在激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)或雙光子激發(fā)熒光顯微鏡(two-photon excitation fluorescence microscope,TPEFM)上,通過逐點(diǎn)掃描來成像.基于統(tǒng)計(jì)分析的TCSPC法避免了熒光強(qiáng)度的直接測量,因而信噪比高,探測效率近乎理想.但為了獲取準(zhǔn)確的計(jì)數(shù),每個(gè)激發(fā)周期內(nèi)產(chǎn)生熒光光子的概率要很低(一般為1%左右),而每個(gè)像素點(diǎn)擬合出一條信噪比較好的衰減曲線至少需要上千光子數(shù),這就導(dǎo)致成像速度通常較慢.此外,由于TCSPC技術(shù)測量熒光壽命的精度很高,因此對硬件設(shè)備要求也較高,如需要能輸出超短脈沖的飛秒激光器,高探測效率、響應(yīng)性能非常好的探測器等.

3 FLIM成像性能的提升

近年來隨著激光器、探測器等相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展,FLIM技術(shù)在成像性能方面的大幅度提升成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).針對前面提到的不同熒光壽命探測方法的優(yōu)缺點(diǎn),成像性能的提升主要體現(xiàn)在FLIM成像速度、熒光壽命測量精度、以及成像質(zhì)量和空間分辨率三個(gè)方面的提升,以下分別進(jìn)行闡述.

3.1 FLIM成像速度的提升

成像速度的提升可以說是各種熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用于活細(xì)胞成像時(shí)的共同追求.如前所述,除門控法外,其他FLIM技術(shù)基本上都存在成像速度較慢的問題.例如,目前應(yīng)用最廣泛的TCSPCFLIM由于需要掃描,而且通常需要多次重復(fù)掃描來為每個(gè)像素采集足夠多的光子用于擬合熒光壽命,因此成像速度較慢,一定程度上限制了其在活細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用、信號傳導(dǎo)等瞬態(tài)過程研究中的應(yīng)用.通過改善硬件性能可一定程度上提升TCSPC-FLIM的成像速度,如Orthaus-Mueller等[14]采用超短死區(qū)時(shí)間的TCSPC模塊和混合型PMT的組合提高了單個(gè)激發(fā)周期的探測效率,實(shí)現(xiàn)了成像速度的提升,從而在對水溶液中擴(kuò)散的熒光珠進(jìn)行成像時(shí)獲得了3幀/s的成像速度(圖像大小為128 pixel×128 pixel,如圖2(a)所示).

圖2 FLIM成像速度的提升 (a)采用超短死時(shí)間TCSPC硬件實(shí)現(xiàn)水溶液中擴(kuò)散熒光珠的動(dòng)態(tài)FLIM成像(128 pixel×128 pixel,3幀/s)[14];(b)采用多焦點(diǎn)多光子激發(fā)SPAD陣列技術(shù)獲取活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的FLIM圖像(256 pixel×256 pixel,15 s/幀)[21]Fig.2.Improvement in FLIM imaging speed:(a)Dynamic FLIM imaging of diffuse fluorescent beads in aqueous solution(128 pixel×128 pixel,3 fps)with ultra-short dead time TCSPC hardware[14];(b)FLIM images of live intracellular protein interactions using multi-focus multiphoton excitation SPAD array technology(256 pixel×256 pixel,15 s/frame)[21].

相比掃描方式,寬場成像可顯著提升成像速度,而近幾年快速發(fā)展起來的單光子雪崩二極管(single photon avalanche diode,SPAD)陣列與TCSPC的結(jié)合為實(shí)現(xiàn)寬場TCSPC-FLIM提供了可能[15,16].SPAD增益高、響應(yīng)速度快,具有單光子探測能力,且可基于標(biāo)準(zhǔn)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體工藝生產(chǎn),既能實(shí)現(xiàn)陣列集成,又能方便地將TCSPC電路整合到每個(gè)像元中,從而實(shí)現(xiàn)寬場TCSPC-FLIM成像.哥倫比亞大學(xué)Shepard等[17]集成了64×64個(gè)SPAD及時(shí)間-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(time-to-digital converter,TDC)模塊,理論分析與模擬表明采用該探測器可使FLIM成像速度達(dá)到100幀/s.不過目前由于SPAD陣列傳感器的像元尺寸過大,填充率偏低[18,19],用于寬場TCSPCFLIM時(shí)還存在分辨率不高等問題,因此尚處于初始發(fā)展階段.而且隨著SPAD陣列傳感器像素?cái)?shù)目的增加,寬場TCSPC-FLIM需要讀取的數(shù)據(jù)量會(huì)急劇增大,這對計(jì)算機(jī)運(yùn)行速度也提出了挑戰(zhàn).針對這一問題,天津大學(xué)Xu等[20]提出基于事件驅(qū)動(dòng)讀出的SPAD傳感器技術(shù),通過僅讀出有效的時(shí)間與位置信息減小數(shù)據(jù)量來提升成像速度.Poland等[21]則結(jié)合SPAD陣列和多焦點(diǎn)多光子激發(fā)TCSPC-FLIM技術(shù),既獲得了與LSCM-FLIM相當(dāng)?shù)目臻g分辨率,又進(jìn)一步提升了成像速度,實(shí)現(xiàn)了對活細(xì)胞中蛋白質(zhì)相互作用過程的FLIM成像(如圖2(b)所示).

除了將掃描變成寬場成像,對掃描方式加以改進(jìn)也是提升成像速度的一種有效途徑.傳統(tǒng)的掃描一般采用振鏡,掃描方式為柵掃描.深圳大學(xué)屈軍樂課題組搭建的基于條紋相機(jī)的雙光子激發(fā)FLIM系統(tǒng)中采用高速振鏡掃描實(shí)現(xiàn)了二維FLIM成像,獲得了50 ps左右的時(shí)間分辨率,并使圖像獲取時(shí)間顯著縮短[22].而對于大多數(shù)生物樣品而言,視場中往往只有部分感興趣區(qū)域.假如掃描時(shí)可跳過感興趣區(qū)域以外的像素,直接針對視野中的若干感興趣區(qū)域掃描,則可節(jié)省大量時(shí)間,提升成像速度.該課題組根據(jù)這一思路發(fā)展了一種基于聲光偏轉(zhuǎn)器(acousto-optic de flector,AOD)尋址掃描的AOD-FLIM技術(shù)[23],通過減少有效掃描面積縮短采集時(shí)間,從而達(dá)到大幅提升成像速度的目的.結(jié)合單粒子定位和反饋控制,他們還進(jìn)一步發(fā)展了可用于運(yùn)動(dòng)粒子FLIM成像和追蹤的單粒子定位FLIM技術(shù)[24],在活細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)目標(biāo)的熒光壽命探測方面具有一定的應(yīng)用前景.

通過擬合算法的改進(jìn)來降低熒光衰減曲線擬合對光子數(shù)的要求也是提升時(shí)域FLIM成像速度的一種思路.傳統(tǒng)的熒光衰減曲線擬合通常采用最小二乘法(least-squares,LS),該算法原理簡單,但要求獲取足夠多的光子數(shù)用于曲線擬合,延長采集時(shí)間可增加光子數(shù),但是降低了成像速度.采用極大似然估計(jì)(maximum likelihood estimate,MLE)算法擬合數(shù)據(jù)可一定程度上降低對光子數(shù)的要求,進(jìn)而可一定程度地提升成像速度[25,26].近幾年提出的相量分析法則無需擬合壽命曲線,而是通過將各像素點(diǎn)的熒光衰減信息直接變換到相量圖(phasor plot)上對應(yīng)的點(diǎn)來獲取壽命信息.該方法不僅簡化了數(shù)據(jù)分析,而且可以方便地實(shí)現(xiàn)單組分與多組分指數(shù)分布的區(qū)分,但目前測量精度還有待提升[5,11,27,28].Lakner等[29]在研究直腸癌3D細(xì)胞模型時(shí)對比分析了相量分析法及傳統(tǒng)的多指數(shù)擬合方法,結(jié)果表明前者在量化分析時(shí)需要較少的初始假設(shè),更加簡便快速.Marois等[30]提出基于泊松統(tǒng)計(jì)的降噪主成因分析(noise-corrected principal component analysis,NCPCA)算法,用于校正時(shí)域FLIM數(shù)據(jù)存在的誤差噪聲,該方法可以更低的光子計(jì)數(shù)來檢測微環(huán)境的分布,速度快,在確定組分?jǐn)?shù)量時(shí)所需光子數(shù)比相量分析法還要少,且不需要事先知道組分?jǐn)?shù)量或熒光分子的衰減動(dòng)力學(xué)常數(shù).

3.2 熒光壽命測量精度的提升

在保證快速FLIM成像的基礎(chǔ)上,如何實(shí)現(xiàn)熒光壽命的準(zhǔn)確測量也是關(guān)鍵問題.其中熒光壽命測量精度可從硬件與軟件兩方面進(jìn)行改善.近年來,隨著超快激光器、高靈敏度探測器的快速發(fā)展,硬件性能及光路質(zhì)量得到了大幅提升,系統(tǒng)噪聲可以更低,信號采集效率可以更高,圖像信噪比提高,因此熒光壽命測量精度也有所提升.但是通過硬件提升壽命測量精度的效果始終有限,且成本較高[31].因而許多科研人員轉(zhuǎn)而通過算法來加以改進(jìn),即解決在較低信噪比或較少光子數(shù)前提下如何保證壽命計(jì)算精度的問題.最簡單的做法是運(yùn)用圖像處理算法對獲得的信噪比較差的熒光壽命圖像先進(jìn)行預(yù)處理,如天津理工大學(xué)的邵永鑫[32]先采用小波變換算法去噪,再結(jié)合遺傳算法(genetic algorithm,GA)、反向傳播(back propagation,BP)算法進(jìn)行小波神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí),從而提高熒光壽命測量的準(zhǔn)確性.中國科學(xué)院大學(xué)劉超[33]同時(shí)對雙門控探測的快速壽命算法(rapid lifetime determination,RLD)及多門控探測的LS擬合算法進(jìn)行了對比研究,結(jié)果表明前者成像速度快但測量精度差,后者則恰好相反,兩者在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中可適用于不同場合.此外他們還對基于列文伯格-馬克夸特(Levenberg-Marquardt,L-M)的高精度熒光壽命算法展開了研究,發(fā)現(xiàn)該算法比RLD和普通的LS具有更好的擬合精度,且能適用不同的儀器響應(yīng)函數(shù)(instrument response function,IRF)模型[34].

針對TCSPC-FLIM,前面提到的MLE算法擬合可以降低對擬合光子數(shù)的要求,在提升成像速度的同時(shí)保證了測量精度[25,26].華中科技大學(xué)曾紹群課題組[31]對一階矩(the first moment,M1)法與傳統(tǒng)的LS進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在壽命較短且光子數(shù)較少的情況下,M1法更具優(yōu)勢.牛津大學(xué)Rowley等[35]提出采用貝葉斯方法(Bayesian analysis,BA)來分析指數(shù)衰減數(shù)據(jù),并以較高的精度對TCSPC系統(tǒng)進(jìn)行建模,再對單指數(shù)與雙指數(shù)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,相比上述的LS與MLE算法,其準(zhǔn)確度提升了兩倍.韓國Yang等[36]還將壓縮感知(compressed sensing,CS)算法用于熒光壽命數(shù)據(jù)分析,提高了對稀疏分布的多組分熒光壽命值估計(jì)的準(zhǔn)確性.這幾種適合低光子數(shù)情形的熒光壽命擬合算法的簡單比較如表1所列.

改善解卷積算法也可以一定程度上提升壽命測量精度.如Zhang和Li[37]通過理論分析和模擬對最小方差拉蓋爾算法(least-squares deconvolution with Laguerre expansion,LSD-LE)進(jìn)行了修正,提出在評估解卷積的性能時(shí)應(yīng)考慮泊松噪聲而非高斯噪聲.西安理工大學(xué)華燈鑫等[38]采用改進(jìn)的向前迭代解卷積算法反演出葉綠素的熒光壽命,獲得了比傳統(tǒng)迭代解卷積算法更高的精度.但這些解卷積算法一般需要先確定準(zhǔn)確的IRF,因此這又涉及到IRF的精確測量.華東師范大學(xué)潘海峰等[39]以飽和碘化鈉溶液猝滅后的熒光素作為樣品,發(fā)展了一種精確測量TCSPC系統(tǒng)IRF的方法,從而提高熒光壽命測量的準(zhǔn)確性.Gao和Li[40]則采用擴(kuò)展卡曼濾波(extended Kalman filter,EKF)算法,同時(shí)估計(jì)出TCSPC-FLIM系統(tǒng)測量的熒光壽命和IRF,避免了對IRF的直接測量,同時(shí)該方法還具有對測量時(shí)間窗不敏感、測量動(dòng)態(tài)范圍大的優(yōu)勢.

表1 低光子數(shù)情形下幾種熒光壽命擬合算法的比較[25,26,31,35,36]Table 1.Comparison of several fluorescence lifetime fitting methods with low photon numbers[25,26,31,35,36].

3.3 成像質(zhì)量和空間分辨率的提升

傳統(tǒng)FLIM技術(shù)由于光學(xué)衍射極限的存在,其成像的空間分辨率被限制在橫向250 nm左右、軸向500 nm左右.結(jié)合近幾年來快速發(fā)展的超分辨成像等先進(jìn)技術(shù),FLIM的成像質(zhì)量和空間分辨率得到了大幅提升.

通過引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)進(jìn)行像差校正,可大幅提升FLIM的成像質(zhì)量.例如,Feeks和Hunter[41]在利用雙光子激發(fā)FLIM對小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行成像以研究視網(wǎng)膜退化過程的工作中,通過引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)校正小鼠眼球引起的像差,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了橫向與軸向的緊聚焦,抑制了背景噪聲及散射光,實(shí)現(xiàn)了對單個(gè)細(xì)胞的分辨,進(jìn)而將這種方法運(yùn)用到臨床醫(yī)學(xué)的檢眼鏡檢查法中,用于對視網(wǎng)膜細(xì)胞的健康狀況進(jìn)行評價(jià).

此外,針對前面提到的寬場FLIM受離焦信號影響,軸向分辨率和成像深度均較差的問題,Hinsdale等[42]嘗試將門控FLIM與結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(structured illumination microscopy,SIM)結(jié)合,Greger等[43]嘗試將寬場頻域FLIM與單面照明顯微術(shù)(single plane illumination microscopy,SPIM)結(jié)合,從而使寬場FLIM也具備“光學(xué)層析”能力,實(shí)現(xiàn)了厚樣品的FLIM成像.

FLIM空間分辨率的大幅提升則主要是通過將已有的FLIM成像方法與超分辨成像技術(shù)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的,其中目前研究較多的是利用受激輻射耗盡(stimulated emission depletion,STED)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)超分辨FLIM成像.例如,英國倫敦帝國理工學(xué)院French等[44,45]將STED與TCSPC-FLIM技術(shù)結(jié)合,通過將掃描光斑大小控制在100 nm以內(nèi)獲得了超衍射極限的FLIM圖像,結(jié)果如圖3(a)所示.在該工作中,他們還利用基于空間光調(diào)制器(spatial light modulator)的數(shù)字全息術(shù)對STED光束進(jìn)行相位調(diào)控,實(shí)現(xiàn)對其輪廓的整形和像差補(bǔ)償,在提升橫向分辨率的同時(shí),大幅提升了軸向分辨率(由685 nm提升到362 nm)[46].浙江大學(xué)劉旭課題組采用連續(xù)光作為STED光,TCSPC技術(shù)測量熒光壽命,結(jié)合納米定位臺對樣品進(jìn)行掃描,實(shí)現(xiàn)了STED-FLIM成像,成像分辨率達(dá)到了70 nm(如圖3(b)所示)[47].深圳大學(xué)屈軍樂課題組將STED-FLIM技術(shù)與自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)相結(jié)合,用于改善STED光的成像質(zhì)量并校正由厚樣品散射引起的像差,進(jìn)一步提升了成像分辨率[48,49].此外,French等[50]還將SIM與FLIM相結(jié)合,用于對膠原蛋白活化后COS細(xì)胞中DDR1受體低聚化的FRET過程進(jìn)行研究.

圖3 結(jié)合STED超分辨技術(shù)實(shí)現(xiàn)FLIM空間分辨率的提升 (a)ATTO 647 N標(biāo)記的NK細(xì)胞的STED-FLIM超分辨熒光壽命圖像(分辨率60 nm)[44];(b)直徑20 nm熒光珠的CW-STED與共聚焦熒光壽命圖像的對比(分辨率70 nm)[47]Fig.3.Improvement in FLIM spatial resolution by combining with STED super resolution imaging:(a)STED-FLIM super resolution fluorescence lifetime image of ATTO 647 N labeled NK cells(resolution 60 nm)[44];(b)CW-STED vs.confocal fluorescence lifetime image of 20 nm diameter fluorescent beads(resolution 70 nm)[47].

表2 FLIM成像性能提升的最新研究進(jìn)展Table 2.Recent progress on improving FLIM imaging performance.

綜上,FLIM成像性能提升的最新進(jìn)展總結(jié)于表2.

4 FLIM技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究

如前所述,FLIM除了具備一般熒光顯微成像的高特異性、高靈敏度等特點(diǎn),還具有對微環(huán)境變化敏感、可定量測量等獨(dú)特的優(yōu)勢,因此近二十年來已在各領(lǐng)域得到較為廣泛的應(yīng)用,尤其是在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、疾病診斷與治療研究,以及納米材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究等方面,近年來FLIM的應(yīng)用已取得許多利用傳統(tǒng)的研究手段無法獲取的數(shù)據(jù),從而為這些領(lǐng)域的快速發(fā)展助力.

4.1 FLIM在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

盡管近幾十年來生物醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展,人們對于細(xì)胞行為及其機(jī)理的研究已經(jīng)越來越深入細(xì)致,但仍然有許多重要問題需要繼續(xù)尋求答案,例如目前關(guān)于細(xì)胞生理代謝過程機(jī)理、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和機(jī)理、植物細(xì)胞光合作用機(jī)理等的研究仍然是細(xì)胞生物學(xué)研究中的熱點(diǎn)問題.FLIM可用于定量監(jiān)測細(xì)胞中微環(huán)境變化的優(yōu)勢恰好為這些問題的研究提供了一種很好的手段.例如,最近美國Walsh等[51]利用一種壽命對鈣離子濃度非常敏感的熒光探針(Oregon Green BAPTA-1)對小鼠海馬體神經(jīng)元進(jìn)行FLIM成像,實(shí)時(shí)觀察了神經(jīng)元在光刺激前后鈣離子濃度的變化,并發(fā)現(xiàn)利用近紅外脈沖光照射時(shí)可引起神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣含量的顯著增加,如圖4(a)所示.French課題組[46]則運(yùn)用FLIM技術(shù)研究了肌肉纖維的肌節(jié)分子結(jié)構(gòu)及免疫突觸信號的傳導(dǎo)過程.為了便于對大量采集數(shù)據(jù)的分析與整理,他們還將FLIM技術(shù)與高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析技術(shù)(high content analysis,HCA)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了FLIM的全自動(dòng)成像,并基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移( fluorescence resonance energy transfer,FRET)對蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行分析[52,53].結(jié)合了HCA的FLIM成像設(shè)備使得我們可以從大量的FLIM圖像中自動(dòng)篩選出有價(jià)值的數(shù)據(jù),這在發(fā)現(xiàn)化學(xué)藥物、研究細(xì)胞分子相互作用中將發(fā)揮重要的作用.

在植物細(xì)胞生物學(xué)研究方面,2016年中國科學(xué)院田文明等[54]采用基于LSCM的FLIM技術(shù),研究了光合系統(tǒng)的能量II傳遞機(jī)理,從而獲取了光合色素在光合作用中傳遞能量的速率信息.荷蘭Blilou等[55]在發(fā)表于《Nature》的工作中,利用FRET-FLIM技術(shù)實(shí)現(xiàn)了植物體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的可視化研究,從而深入揭示了根尖細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)理(如圖4(b)所示).日本Kodama[56]利用FLIM技術(shù)獲得了熒光蛋白標(biāo)記的向光素(一種位于葉綠體外圍的藍(lán)光感受器)的清晰圖像.FLIM在植物細(xì)胞研究中的應(yīng)用難點(diǎn)之一就是植物內(nèi)葉綠體自發(fā)熒光的干擾,因?yàn)樵趥鹘y(tǒng)FLIM成像條件下僅通過采用合適的發(fā)射波長與激發(fā)波長是很難完全消除葉綠體的自體熒光影響的.該課題組利用葉綠體自體熒光壽命較短(僅為ps量級)的特點(diǎn),采用簡單的時(shí)間延遲門控成像技術(shù)來消除它們的影響.Camborde等[57]采用具有高時(shí)間分辨率的條紋相機(jī)探測FLIM圖像,并通過減小掃描視場縮短采集時(shí)間,從而結(jié)合FRET技術(shù)檢測了植物葉片中核酸與蛋白質(zhì)的相互作用.

4.2 FLIM在疾病診斷與治療方面的應(yīng)用

利用FLIM技術(shù)對臨床上一些典型疾病進(jìn)行診斷及治療的研究也是近年來的一個(gè)前沿研究熱點(diǎn).研究者們通常采用動(dòng)物自體熒光壽命來研究體內(nèi)細(xì)胞的代謝狀況,從而引導(dǎo)臨床上的疾病診斷與治療.Robert等[58]對患有黑色素瘤小鼠的單層上皮細(xì)胞進(jìn)行多光子FLIM成像,通過細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性熒光物質(zhì)輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的含量比率來實(shí)現(xiàn)成像,從而監(jiān)測腫瘤的動(dòng)態(tài)發(fā)展進(jìn)程.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在腫瘤成長過程中,該比率會(huì)顯著增大,但NADH自身長/短壽命組分的比例則基本保持不變.該工作表明,FLIM技術(shù)可以非侵入式、高靈敏、快速地反映黑色素瘤的發(fā)展進(jìn)程,將在診斷及治療黑色素瘤中發(fā)揮重要作用.此外,由于NAD(P)H、黃素腺嘌呤二核苷酸( flavin adenine dinucleotide,FAD)、色氨酸(tryptophan,Trp)等內(nèi)源性熒光物質(zhì)及NAD(P)H與FAD的氧化還原比例能反映活細(xì)胞或組織內(nèi)的代謝狀況,利用FLIM技術(shù)監(jiān)測這些生化參數(shù)的變化還能用于實(shí)時(shí)反映抗癌藥物的治療效果.Alam等[59,60]利用三通道多光子TCSPC-FLIM技術(shù),獲取了運(yùn)用抗癌藥物治療前后前列腺癌細(xì)胞內(nèi)這幾種物質(zhì)的熒光壽命,結(jié)果表明治療后它們的平均熒光壽命增加,且NAD(P)H,FAD的氧化還原比例下降,從而反映了抗癌藥物的治療效果(如圖5(a)所示).在此基礎(chǔ)上,他們又運(yùn)用FRET-FLIM技術(shù)研究了前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Trp的構(gòu)造變化與Trp-NADH相互作用之間的關(guān)系.而Shirmanova等[61]則利用FLIM技術(shù)研究了培養(yǎng)的癌細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)腫瘤在自然生長和化學(xué)治療兩種情況下的生物能量代謝及微觀黏度變化,通過NADPH自體熒光壽命的測量發(fā)現(xiàn)了治療后癌細(xì)胞的游離態(tài)NADPH相對含量減小,且質(zhì)膜黏滯度顯著增大.哥倫比亞大學(xué)Kaminski等[62]利用熒光染料的自猝滅效應(yīng)可影響其自身熒光壽命從而反映淀粉狀蛋白結(jié)構(gòu)的性質(zhì)(如圖5(b)所示),發(fā)展了一種可反映淀粉狀蛋白聚集狀態(tài)的FLIM傳感器,該傳感器動(dòng)態(tài)范圍寬,測量時(shí)對蛋白質(zhì)聚集過程不會(huì)產(chǎn)生干擾,且能高通量、定量地反映淀粉類蛋白的聚集狀態(tài).在此基礎(chǔ)上他們采用SIM-FLIM技術(shù)對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)相關(guān)蛋白τ的K18蛋白片段及與亨廷頓氏病(Huntington’s disease,HD)相關(guān)的聚谷氨酰胺蛋白進(jìn)行了研究,對診斷和治療臨床上的神經(jīng)退化疾病具有較大意義.

圖4 FLIM在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用 (a)FLIM用于鈣離子濃度變化的定量監(jiān)測[51];(b)FLIM結(jié)合FRET用于分析擬南芥根尖細(xì)胞發(fā)育機(jī)理[55]Fig.4.Applications of FLIM in basic biomedical research:(a)FLIM applied for quantitative monitoring of calcium ion concentration[51];(b)FLIM combined with FRET for analyzing the development mechanism of Arabidopsis root tip cells[55].

圖5 FLIM在疾病診斷與治療方面的應(yīng)用 (a)前列腺癌細(xì)胞中Trp,NAD(P)H,FAD在治療前后的平均壽命變化監(jiān)測[60];(b)不同標(biāo)記比例和孵育時(shí)間下K18-Atto532淀粉狀蛋白在體內(nèi)的聚集狀態(tài)[62];(c)phasor-FLIM用于區(qū)分AK,BD,BCC等不同的皮膚疾病[66]Fig.5.Applications of FLIM in diagnosis and treatment of diseases:(a)Monitoring changes of the mean lifetime of Trp,NAD(P)H,and FAD in prostate cancer cells before and after treatment[60];(b)aggregation of K18-Atto532 amyloid in vivo at different labeling ratios and incubation times[62];(c)phasor-FLIM applied for differentiating different skin diseases such as AK,BD and BCC[66].

在國內(nèi)也有多個(gè)課題組在開展FLIM技術(shù)的疾病診療研究.華東師范大學(xué)田陽等合成了一種具有高特異性、高雙光子吸收截面和低毒性的新型鋅離子熒光比率探針,并用于活細(xì)胞內(nèi)鋅離子的FLIM成像,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比正常小鼠,患AD的小鼠其海馬組織中的鋅離子濃度要更高[63].上海理工大學(xué)宋成利等[64]對比分析了正常鼻咽及癌變組織中自體熒光壽命,并研究了生理鹽水及組織自身光學(xué)特性對熒光壽命測量的影響.南京中醫(yī)藥大學(xué)金路[65]運(yùn)用多光子激發(fā)FLIM技術(shù)研究了大鼠病理狀態(tài)下肝臟的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)及代謝情況,對臨床上脂肪肝的檢測與治療具有重要的參考意義.深圳大學(xué)Luo等[66]對蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin)染色的病理切片進(jìn)行雙光子FLIM成像,并通過引入相量分析法對熒光壽命進(jìn)行分區(qū)和篩選,發(fā)展了一種可區(qū)分基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma,BCC)、光化性角化病(actinic keratosis,AK)和博文病(Bowen disease,BD)等不同皮膚疾病的方法,顯著提高了診斷的準(zhǔn)確性,為組織病理學(xué)分析提供了一種簡單可行的新方法(如圖5(c)所示).

4.3 FLIM在納米材料生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展,應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像的新型納米材料也在不斷涌現(xiàn).目前常見的新型納米材料有上轉(zhuǎn)換材料、量子點(diǎn)(quantum dot,QD)、碳量子點(diǎn)、金納米顆粒及其他納米顆粒[67].納米材料的制備和應(yīng)用是一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域,上述的納米材料一般都具有較好的光學(xué)性質(zhì),但具體應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像和研究中則還有諸多問題和未知效應(yīng)需要研究和探索.例如量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性較好,不易漂白,但由于具有微毒性,其生物安全性一直備受爭議.基于這些納米材料獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì),FLIM為納米材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究提供了一種新的思路.例如,英國愛丁堡大學(xué)Giraud等[68]利用FLIM技術(shù)研究了QD標(biāo)記在DNA雜交事件檢測中的應(yīng)用,并通過時(shí)間門控探測將QD的微陣列壽命圖像對比度提高了1.8倍,從而達(dá)到飛摩爾的靶向靈敏度.澳大利亞昆士蘭大學(xué)Lin等[69]與德國BH公司Becker合作,采用TCSPCFLIM技術(shù)對注射了氧化鋅納米顆粒的志愿者皮膚進(jìn)行了FLIM成像并研究其代謝狀態(tài),從而為該納米粒子在皮膚中的滲透和生物效應(yīng)研究發(fā)展了一種非侵入性的成像和檢測手段.德國Chen等[70]制備了兩種類型的脫鎂葉綠酸-HSA(Pheo-HSA)納米顆粒,并利用LSCM-FLIM對它們在細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放過程進(jìn)行研究,從而得出這種納米粒子可作為光動(dòng)力治療(photodynamic therapy)藥物載體的結(jié)論.深圳大學(xué)Luo等[71]利用基于相量分析的FLIM技術(shù)對合成的聚合物納米粒子PAHCit/多柔比星(doxorubicin,DOX)的藥物釋放過程進(jìn)行成像,通過監(jiān)測細(xì)胞間質(zhì)中DOX熒光壽命的動(dòng)態(tài)變化來評估納米載體的藥物釋放效率.吉林大學(xué)Zhang等[72,73]將雙光子激發(fā)FRET-FLIM技術(shù)與表面等離子體激元共振技術(shù)結(jié)合,利用增強(qiáng)型的能量轉(zhuǎn)移發(fā)展了一種可以監(jiān)測金納米顆粒在活細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞過程的新方法,這對于研究體內(nèi)和體外的生物成像傳感及單分子追蹤都有很大幫助.

5 總結(jié)與展望

熒光顯微成像具有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,其中利用熒光分子的壽命進(jìn)行成像的FLIM技術(shù)更是由于具有能定量反映微環(huán)境參數(shù)分布和變化的獨(dú)特優(yōu)勢而成為一種重要的研究工具.FLIM技術(shù)分為頻域法和時(shí)域法兩類,其中時(shí)域法又有門控法、條紋相機(jī)法和TCSPC法等.TCSPC-FLIM因同時(shí)具有高時(shí)間分辨率、高信噪比、寬動(dòng)態(tài)范圍和不受激發(fā)光強(qiáng)度波動(dòng)等因素影響等優(yōu)點(diǎn)而成為目前應(yīng)用最廣泛的FLIM技術(shù).近年來FLIM技術(shù)的發(fā)展主要側(cè)重于成像性能的提升和應(yīng)用范圍的拓寬這兩方面.TCSPC模塊和PMT性能的進(jìn)一步改善、AOD尋址掃描方式的應(yīng)用一定程度上提升了FLIM的成像速度,而SPAD陣列的發(fā)展及其與TCSPC結(jié)合發(fā)展起來的寬場TCSPC-FLIM則有望大幅提升成像速度;壽命擬合算法和解卷積算法的改進(jìn)有利于在快速FLIM成像的前提下進(jìn)一步提升壽命測量的精度;基于自適應(yīng)光學(xué)的像差校正技術(shù)使得FLIM的成像質(zhì)量進(jìn)一步提升,而超分辨顯微成像技術(shù)與FLIM的結(jié)合則大幅提升了成像的空間分辨率,獲得了超分辨FLIM圖像.基于FLIM成像技術(shù)上的這些進(jìn)步,目前FLIM在細(xì)胞生物學(xué)中一些重要科學(xué)問題的研究、臨床醫(yī)學(xué)上一些重大疾病的診斷與治療研究,以及納米材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究等方面均有廣泛應(yīng)用,并取得了許多利用傳統(tǒng)的研究手段無法獲取的數(shù)據(jù).但是另一方面,目前FLIM的成像速度總體而言仍然不夠快,或者說在進(jìn)行快速FLIM成像時(shí)仍然不能夠獲得精度足夠高的壽命數(shù)據(jù),因此FLIM的成像性能還有待進(jìn)一步提升.相信未來隨著激光技術(shù)、探測器技術(shù)、超分辨成像等相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展,同時(shí)結(jié)合算法和熒光探針合成技術(shù)的進(jìn)步,FLIM技術(shù)在成像速度、測量精度、成像空間分辨率等方面的性能還將得到進(jìn)一步提升,從而可在更多領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用.