徐明芝 李洪 白亞飛 陳汝滿 王宇靜

(1.海南省人民醫(yī)院血液凈化中心，海南 海口 570311；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院血透科，海南 ?？?570208)

慢性腎病患者需長(zhǎng)期進(jìn)行血液透析，才能維持其正常生活，但是長(zhǎng)期維持血液透析往往會(huì)增加結(jié)核分枝桿菌感染率[1]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染的血液透析患者死亡率也顯著高于普通血液透析患者[2]。慢性腎病會(huì)引起相關(guān)免疫功能缺陷，會(huì)使?jié)撛谛越Y(jié)核分枝桿菌感染發(fā)展為活動(dòng)性疾病，這可能是造成其死亡率較高的主要原因[3]。目前早期篩選出結(jié)核高風(fēng)險(xiǎn)患者，并使用藥物預(yù)防并治療潛在性結(jié)核分枝桿菌感染患者是治療結(jié)核病的最佳方法，此方法也被廣泛應(yīng)用于臨床[4]。因此目前急需探尋診斷潛在性結(jié)核分枝桿菌感染的試驗(yàn)方法，做到早診斷、早治療。本研究對(duì)結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)與干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)血液透析患者結(jié)核分枝桿菌感染的方法進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)不同方法檢測(cè)血液透析患者結(jié)核分枝桿菌感染的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 200例觀察對(duì)象均為2015年9月～2016年9月于我院因腎病行血液透析且疑似結(jié)核感染患者，用結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)與干擾素-γ釋放試驗(yàn)(IGRA)分別檢測(cè)200例患者，男性103例，女性97例；平均年齡35～56歲；血液透析時(shí)間10～17天。分析比較兩種方法診斷血液透析患者結(jié)核分枝桿菌感染的陽(yáng)性率、敏感性、特異性、假陽(yáng)性率、假陰性率及與卡介苗接種和既往結(jié)核感染的相關(guān)性。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合第七版內(nèi)科學(xué)腎病需血液透析診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。②透析患者有咳嗽、咳痰或咳血，乏力、盜汗、午后低熱等結(jié)核感染癥狀，且過(guò)去6個(gè)月未服用免疫抑制劑及抗生素治療。③經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得患者家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、肺等臟器可見(jiàn)顯著病變患者；合并嚴(yán)重感染、凝血功能障礙等患者；透析前曾服用過(guò)抗結(jié)核藥物或免疫抑制劑治療患者。

1.2 儀器與方法

1.2.1 儀器與試劑 L550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(湖南湘儀有限公司)， Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Microplate Reader)，電熱數(shù)顯恒溫水浴箱(JOANLAB公司)等。試劑：PPD試劑(北京諾德生物科技有限公司)，結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)(ELISA) 試劑盒(北京諾爾貝迪科技有限公司)。

1.2.2 結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST) 在患者前臂掌側(cè)下三分之一部位皮膚處，注射PPD試劑0.1ml，至皮膚出現(xiàn)一5～6mm的圓形皮丘。注射時(shí)注意采用皮膚內(nèi)注射法，且注射速度要緩慢，避免過(guò)快。同時(shí)注意觀察患者有無(wú)不良反應(yīng)。在48小時(shí)后用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄硬結(jié)縱向和橫向直徑，硬結(jié)平均直徑=(縱徑+橫徑)/2。硬結(jié)平均直徑如果在5mm以下為陰性反應(yīng)；在5mm以上(包含5mm) 或局部有水皰、壞死、淋巴管炎等均判斷為陽(yáng)性反應(yīng)[6]。

1.2.3 干擾素-γ釋放試驗(yàn)(IGRA) 取待測(cè)者空腹8小時(shí)后靜脈血3～5ml，加入肝素抗凝，顛倒混勻后，均分成三等份分別加入試劑盒三種不同試劑管(試劑管內(nèi)裝分別裝有陽(yáng)性反應(yīng)劑、陰性反應(yīng)劑和結(jié)核抗原)中，再次混勻后，37℃水浴箱內(nèi)孵育24小時(shí)，離心取上清液，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟檢測(cè)γ-干擾素。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄。按測(cè)量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并判斷結(jié)核分枝桿菌感染情況。

1.2.4 結(jié)核感染診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、病理學(xué)診斷、痰涂片和細(xì)菌培養(yǎng)及X線等輔助診斷，并結(jié)合2016《ATS/IDSA/CDC臨床實(shí)踐指南：成人和兒童結(jié)核病的診斷》臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)判斷患者是否為結(jié)核分枝桿菌感染。

2 結(jié)果

2.1 兩組試驗(yàn)方法陽(yáng)性檢出患者一般情況比較 兩種試驗(yàn)方法陽(yáng)性檢出患者年齡、血液透析時(shí)間、有卡介苗疤痕人數(shù)、性別等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兩種試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果比較 結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)與干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)血液透析患者結(jié)核分枝桿菌感染結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩種試驗(yàn)方法陽(yáng)性檢出患者一般情況比較±s)Table 1 The general data of positive detection of patients

表2200例血液透析患者結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)結(jié)果比較

Table2ThehemodialysispatientswithMycobacteriumtuberculosisinfection

IGRATST(n)陽(yáng)性陰性合計(jì)[n,(×10-2)]陽(yáng)性6393156(78)陰性39544(22)合計(jì)102(51)98(49)200231.837P0.000

2.3 BCG疫苗接種、結(jié)核病史與兩種檢測(cè)方法相關(guān)性比較 IGRA檢測(cè)陽(yáng)性與卡介苗接種史、結(jié)核病史均相關(guān)(P<0.05)，TST檢測(cè)陽(yáng)性與卡介苗接種史具有相關(guān)性(P<0.05)，但與結(jié)核病史不相關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3BCG疫苗接種、結(jié)核病史與兩種檢測(cè)方法相關(guān)性比較

Table3TherelationshioofBCGVaccinationandTuberculosisHistoryandthetwodetectionmethods

因素IGRA陽(yáng)性TST陽(yáng)性RPRPBCG疫苗接種6.430.032.540.02結(jié)核病史5.570.013.660.96

2.4 兩種試驗(yàn)方法靈敏性、特異性比較 干擾素-γ釋放試驗(yàn)靈敏性、特異性均高于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)，其假陽(yáng)性率、假陰性率均低于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)，見(jiàn)表4。

表4 兩種試驗(yàn)方法靈敏性、特異性、假陽(yáng)性率、假陰性率比較[n(×10-2 )]Table 4 The sensitivity, specificity, false positive rate and false negative rate

3 討論

長(zhǎng)期維持透析的腎病患者，由于免疫功能缺陷、營(yíng)養(yǎng)不良等多種原因，其感染結(jié)核分枝桿菌的概率比正常人群高10～25倍[7]。近年來(lái)，隨著慢性腎病需維持透析的患者人數(shù)不斷增加，血液透析合并結(jié)核分枝桿菌感染人數(shù)也隨之增加，由于其發(fā)病隱匿，患者抵抗力差，結(jié)核桿菌多通過(guò)血液播散到全身多個(gè)臟器，預(yù)后多不好，且死亡率較一般結(jié)核感染者高[8]。目前早期篩查選出結(jié)核高風(fēng)險(xiǎn)患者，并使用藥物預(yù)防治療潛在性結(jié)核分枝桿菌感染患者是治療結(jié)核病的最佳方法，也被廣泛應(yīng)用于臨床[9]。因此目前急需探尋診斷潛在結(jié)核分枝桿菌感染的試驗(yàn)方法，做到早診斷、早治療。較早發(fā)現(xiàn)、檢測(cè)并治療潛在的結(jié)核桿菌感染者，可以有效防止其發(fā)展到活動(dòng)性結(jié)核，避免其感染他人和醫(yī)務(wù)工作者。這就使得在長(zhǎng)期維持透析的腎病患者中篩查結(jié)核桿菌感染者變得尤為重要，因此目前臨床上提倡應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期維持透析的腎病患者定期篩有無(wú)結(jié)核桿菌感染。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)長(zhǎng)期以來(lái)一直是檢測(cè)結(jié)核桿菌感染的標(biāo)準(zhǔn)方法[10]。然而，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)仍存在一些缺點(diǎn)和不足：①透析患者結(jié)果敏感性、特異性不足，試驗(yàn)結(jié)果易出現(xiàn)較多假陽(yáng)性、假陰性。②會(huì)與接種過(guò)卡介苗的非結(jié)核分枝桿菌交叉反應(yīng)，影響試驗(yàn)結(jié)果。③結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)若出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，會(huì)給患者帶來(lái)強(qiáng)烈的不適感，嚴(yán)重影響患者及家人正常生活。④結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，干擾因素較多，且會(huì)給患者生活帶來(lái)諸多不便[11]。

隨著科技水平的不斷進(jìn)步與發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)也不斷提升，干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)血液透析結(jié)核桿菌感染也被廣泛應(yīng)用于臨床[12]。當(dāng)結(jié)核桿菌入侵人體機(jī)體后，其特異性抗原會(huì)激活機(jī)體內(nèi)血液和體液內(nèi)單核細(xì)胞，并刺激T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞釋放大量干擾素-γ[13]。這便是干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)血液透析結(jié)核桿菌感染的主要原理。孫琳等[14]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生大量的外源性抗原和內(nèi)源性抗原，經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理后，經(jīng)過(guò)MHCⅡ類和MHCⅠ類兩種不同抗原處理、提取方法，最終被CD4+T、CD8+T細(xì)胞識(shí)別處理。激活的CD4+T細(xì)胞可增加干擾素-γ釋放，同時(shí)干擾素-γ釋放又刺激抗原提成細(xì)胞，使其表面的MHCⅡ分子表達(dá)增加，最終增加提成細(xì)胞的抗原提提成能力[15-17]。更重要的是，干擾素-γ是一種巨噬細(xì)胞的強(qiáng)效激活因子。機(jī)體內(nèi)感染過(guò)程的進(jìn)展與預(yù)后，與淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞兩者的相互作用密切相關(guān)，機(jī)體感染結(jié)核桿菌后，巨噬細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)的首道防御細(xì)胞會(huì)大量吞噬結(jié)核分枝桿菌，并會(huì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)將其消化成不同大小的片斷[18]。研究表示，有部分干擾素-γ來(lái)源于激活的CD8+T細(xì)胞[19-20]。因此，被結(jié)核分枝桿菌刺激過(guò)的淋巴細(xì)胞，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫記憶，當(dāng)相關(guān)抗原再次入侵機(jī)體時(shí)，Th1細(xì)胞會(huì)受到刺激釋放干擾素-γ。因此，體內(nèi)干擾素-γ釋放水平大連升高可能提示結(jié)核桿菌感染或結(jié)核桿菌致敏[21-22]。

干擾素-γ釋放試驗(yàn)作為當(dāng)前篩查和診斷透析患者結(jié)核感染的一種輔助診斷，彌補(bǔ)了結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)的一些不足，其試驗(yàn)耗時(shí)短，且給受試者帶來(lái)的影響較小。但是其同樣存在一些不足之處：①試驗(yàn)需要采取一定量的靜脈血，會(huì)對(duì)患者進(jìn)行有創(chuàng)操作，需要患者具有一定的依從性。②采集的靜脈血需及時(shí)處理，如若樣本放置時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般采集的新鮮血液要在2小時(shí)內(nèi)盡快完成試驗(yàn)。③干擾素-γ釋放試驗(yàn)在孵育過(guò)程中，要注意避免污染，影響檢測(cè)結(jié)果。④該試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件、試驗(yàn)操作人員均有較高要求，且檢測(cè)成本較高，在基層醫(yī)院推廣有一定難度。因此，為了進(jìn)一步提高臨床確診率，患者診斷過(guò)程中應(yīng)該根據(jù)本地區(qū)經(jīng)濟(jì)條件、實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行診斷，患者可以先進(jìn)行熒光定量TST檢測(cè)，對(duì)于疑似患者則可以進(jìn)行干擾素-γ釋放試驗(yàn)，發(fā)揮不同診斷方案優(yōu)勢(shì)，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，相較于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)，干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)血液透析患者結(jié)核分枝桿菌感染檢出陽(yáng)性率高，結(jié)果更準(zhǔn)確，敏感性、特異性高，假陽(yáng)性、假陰性率低，更適用于長(zhǎng)期血液透析患者對(duì)結(jié)核桿菌感染情況的篩選，可在臨床推廣應(yīng)用。