鄔亭亭 劉平 郭術(shù)良 魏強(qiáng) 羅永艾

(1.成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610031；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016；3.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 401220；4.成都市天府新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)二科，四川 成都 610213)

我國是全球結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)耐藥形勢嚴(yán)峻。耐藥結(jié)核病的流行嚴(yán)重威脅我國結(jié)核病的防治工作，已經(jīng)成為我國結(jié)核防控關(guān)注重點(diǎn)。噬菌體是一種細(xì)菌依賴性病毒，可以裂解細(xì)菌，具備抗菌潛力。噬菌體治療銅綠假單胞菌等耐藥菌屬獲得成功[1，2]的報道提示，分枝桿菌噬菌體具備治療耐藥結(jié)核病的潛力，為耐藥結(jié)核病治療提供新思路。本文研究分枝桿菌噬菌體DNAⅢ的生物學(xué)特性和抗耐藥MTB的作用，為抗耐藥MTB噬菌體雞尾酒療法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①噬菌體及其宿主菌 噬菌體TM4由美國匹茲堡大學(xué)Hutful教授惠贈；噬菌體DNAⅢ、Sedeg、Legendre、33D、BO4、Clark和Leo由加拿大Laval大學(xué)贈送；噬菌體D29和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis ,MS) mc2155由中國藥品生物制品檢定所王國治教授贈送；分枝桿菌臨床株由本課題組2010年5月～2011年4月期間從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)核病人痰中分離，比例法檢測藥敏；MTB H37Rv購于重慶市肺科醫(yī)院。②主要試劑：OADC增菌液(美國sigma公司)，7H9/7H10培養(yǎng)基(美國BD公司)，福氏完全佐劑(美國sigma公司)，羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索公司)。實(shí)驗(yàn)動物:新西蘭大耳白兔(符合倫理要求)由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的制備及噬菌斑觀察 參照文獻(xiàn)方法[3]，采用雙層瓊脂培養(yǎng)法制備噬菌體，次日觀察噬菌斑。

1.2.2 透射電鏡 根據(jù)λ噬菌體提取方法[4]，取20 uL純化的噬菌體DNAⅢ液滴于銅網(wǎng)上，15min自然沉降后，加磷鎢酸(20 g/L，pH7.0)10ul于銅網(wǎng)上染色10 min，透射電鏡觀察顆粒形態(tài)。

1.2.3 最佳感染復(fù)數(shù)(muitiplicity of infection，MOI)的測定 參照文獻(xiàn)方法[5]，設(shè)置不加宿主菌的噬菌體和不加噬菌體的宿主菌為對照組，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，每個MOI做兩份取平均值。測定最小MOI(噬菌體感染宿主菌 24 h后全部MS被裂解的MOI)和最佳MOI(產(chǎn)生最高噬菌體滴度的MOI)。

1.2.4 一步生長曲線 參照文獻(xiàn)方法[6]，設(shè)置對照組(①不加宿主菌的噬菌體;②不加噬菌體的宿主菌)，各時間點(diǎn)均作兩份復(fù)管取平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。繪制噬菌體DNAⅢ一步生長曲線，根據(jù)裂解量計算公式計算DNAⅢ裂解量。

1.2.5 噬菌體理化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) ①噬菌體的熱穩(wěn)定性檢測實(shí)驗(yàn)：將滴度為1010pfu/mL的DNAⅢ噬菌體原液分別置于37℃、60℃、70℃恒溫水浴箱中溫浴1 h，15 min取樣一次，立即冰浴至室溫，測定噬菌體滴度。②噬菌體的pH穩(wěn)定性檢測實(shí)驗(yàn)：分別取4.5ml不同pH的7H9液加入試管中，置于25℃的恒溫水浴箱中，溫度恒定后加入0.5 mL的DNAⅢ原液，恒溫1 h，測定噬菌體滴度。③不同pH值環(huán)境下噬菌體裂解能力實(shí)驗(yàn)：將10 uL DNAⅢ液加入到MS中(0.2 mL，對數(shù)生長期)，混勻后共孵育10min。制備pH為7.4和5的培養(yǎng)平板，雙層平板培養(yǎng)法培養(yǎng)。

1.2.6 噬菌體寬噬實(shí)驗(yàn) 雙層瓊脂培養(yǎng)基上分別制成均勻的菌苔(宿主菌：分枝桿菌各臨床分離株)。在菌苔上滴加1×109pfu/mL的DNAⅢ噬菌體液，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6～8周后觀察結(jié)果。

1.2.7 血清中和實(shí)驗(yàn)和交叉中和實(shí)驗(yàn) ①DNAⅢ抗血清制備：按方法[5]制備抗血清。②血清中和實(shí)驗(yàn)：按照文獻(xiàn)[7]方法，測定抗DNAⅢ血清K值。

式中D是抗血清稀釋度，P為經(jīng)t分鐘后測定的噬菌體滴度，P0為未加抗血清時測定的噬菌體滴度，本實(shí)驗(yàn)中t=5。③血清交叉中和實(shí)驗(yàn)：按照文獻(xiàn)[7]方法，8株噬菌體與DNAⅢ的抗血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，根據(jù)上述公式計算K值。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體DNAⅢ噬菌斑及噬菌體透射電鏡

2.1.1 DNAⅢ噬菌斑形態(tài)：平均直徑約為1 mm，圓形透明，見圖1-A。

2.1.2 噬菌體透射電鏡：由透射電鏡(見圖1-B)可見噬菌體DNAⅢ顆粒由一個長多面體立體對稱的頭部和尾部組成，頭部直徑(57±8.9 )nm，尾長(208±28.7 )nm。分枝桿菌噬菌體DNAⅢ為長尾噬菌體。

2.2 噬菌體DNAⅢ最佳MOI、最低MOI測定 DNAⅢ產(chǎn)生最多子代噬菌體的M0I為0.0001，為噬菌體DNAⅢ的最佳MOI；M0I分別為10、1、0.1、0.01和0.001時，共培養(yǎng)24 h后，所有宿主菌MS被裂解，DNAⅢ感染MS的最低MOI為0.001，見表1。

2.3 噬菌體DNAⅢ一步生長曲線 噬菌體DNAⅢ感染MS的潛伏期為165 min。根據(jù)裂解量計算公式計算噬菌體DNAⅢ感染MS的裂解量為28，見圖2。

2.4 噬菌體理化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 噬菌體DNAⅢ熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：顯示噬菌體DNAⅢ對熱敏感，70℃恒溫加熱15min即可滅活全部DNAⅢ，見圖3A。

圖1 噬菌體DNAⅢ噬菌斑(A)及噬菌體DNAⅢ透射電鏡圖(B)Figure 1 Plaques produced of phage DNAⅢ (A) and electron micrograph of DNAⅢ (B)

圖2 分枝桿菌噬菌體DNAⅢ的一步生長曲線Figure 2 One-step growth curve for phage DNAⅢ

2.4.2 噬菌體DNAⅢ pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：顯示在酸堿環(huán)境明顯影響DNAⅢ的存活率，pH12.0時和pH4.0時DNAⅢ的存活率均為0，見圖3B。

2.4.3 不同pH值環(huán)境下噬菌體裂解能力實(shí)驗(yàn)：PH值為5的環(huán)境下依然有部分噬菌體能裂解宿主菌，據(jù)此推測DNAⅢ不僅能裂解體液中的宿主菌，還有可能裂解巨噬細(xì)胞中的宿主菌,見圖4。

2.5 噬菌體DNAⅢ寬噬實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNAⅢ不能有效裂解耐藥分枝桿菌臨床分離株，對耐藥結(jié)核分枝桿菌的裂解率達(dá)78.26%。噬菌體DNAⅢ是寬噬噬菌體，見表2。

圖3 溫度(A)、酸堿(B)對噬菌體DNAⅢ活力的影響Figure 3 Effects of temperature and pH on livability of phage DNAⅢ.

圖4 pH值對噬菌體DNAⅢ裂解能力的影響Figure 4 Effects of pH on lysing of phage DNAⅢ

表2 噬菌體DNAⅢ裂解譜實(shí)驗(yàn)Table 2 Broad lysing experiment of phage DNAⅢ

注：XDR-TB：extensively drug resistant tuberculosis，泛耐藥結(jié)核菌；MDR-TB：Multidrug-Resistant Tuberculosis，多重耐藥結(jié)核菌。

2.6 血清中和實(shí)驗(yàn)及交叉中和實(shí)驗(yàn) 抗DNAⅢ血清稀釋1000倍后仍能有效中和DNAⅢ對宿主菌的吸附與感染(K=770.01)，但只稀釋10倍時才能中和Legendre, BO4和33D對宿主菌的吸附與感染；原液才能中和噬菌體Sedge和Leo對宿主菌的吸附與感染；DNAⅢ抗血清不能綜合D29對宿主菌的吸附與感染，見表3。

表3噬菌體DNAⅢ抗血清中和實(shí)驗(yàn)和交叉中和實(shí)驗(yàn)

Table3NeutralizationtestandcrossneutralizationtestofphageDNAⅢ

噬菌體抗DNAⅢ 血清DP0PKLegendre10303493.64TM4100222480BO41015268 1.61Sedgeundiluted24460.7233D10217323.82Clark252961913.71Leoundiluted305210.53D29undiluted244210-DNAⅢ10002365770.01

注：D. 抗血清稀釋度; P0. 未加抗血清時測定的噬菌體滴度; P. 經(jīng)5 min后測定的噬菌體滴度

3 討論

目前結(jié)核病的主要治療方式為化療。50年沒有突破性的抗結(jié)核新藥問世，結(jié)核藥物研發(fā)嚴(yán)重滯后。面對龐大的結(jié)核病患病人數(shù)和死亡人數(shù)的嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)，急需開發(fā)新的抗結(jié)核治療藥物。

分枝桿菌噬菌體能夠裂解結(jié)核分枝桿菌，有望用于耐藥結(jié)核病的治療[8]。作為目前研究最詳細(xì)的分枝桿菌噬菌體，F(xiàn)ord等于1998年已完成D29的全基因組測序。國內(nèi)已有幾個研究團(tuán)隊(duì)將D29用于結(jié)核病的治療[9-10]，同時發(fā)現(xiàn)MTB對D29耐藥現(xiàn)象。細(xì)菌對噬菌體快速耐藥變異，一直是噬菌體療法難以推廣的巨大阻礙[11]。國外已有研究成功利用噬菌體"雞尾酒療法"治療其他細(xì)菌感染，噬菌體"雞尾酒療法"不僅能提高噬菌體殺菌療效，還能延緩細(xì)菌對噬菌體產(chǎn)生耐藥性[1,12-14]。綜合之前的研究，本課題組提出分枝桿菌噬菌體"雞尾酒療法"抗耐藥MTB的科學(xué)構(gòu)想。通過從國外引進(jìn)和自主分離多株分枝桿菌噬菌體，用于篩選"雞尾酒療法"的噬菌體配方。通過研究分枝桿菌噬菌體DNAⅢ基本生物學(xué)特征，篩選宿主譜寬，無交叉吸附表位的分枝桿菌噬菌體，為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法抗耐藥MTB研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

烈性噬菌體能在宿主菌體內(nèi)迅速增殖并裂解細(xì)菌。噬菌體DNAⅢ的噬菌斑透明清晰，為烈性噬菌體的噬菌斑特征。Pedulla等的實(shí)驗(yàn)[15]和我們的前期實(shí)驗(yàn)[16]發(fā)現(xiàn)長尾噬菌體能殺滅休眠菌。這是因?yàn)殚L尾噬菌體的卷尺蛋白具有Motif 3基序，該基序能促進(jìn)休眠菌復(fù)蘇。因此我們有理由相信長尾噬菌體科噬菌體DNAⅢ也具備殺滅MTB休眠菌的潛力，為減少結(jié)核病復(fù)發(fā)提供新思路[17]。

通過最佳MOI的測定，本研究發(fā)現(xiàn)少量噬菌體DNAⅢ與宿主菌共培養(yǎng)即可提供噬菌體療法所需的大量噬菌體。通過最低MOI的測定發(fā)現(xiàn)DNAⅢ對MS極度易感。

噬菌體DNAⅢ感染MS的潛伏期是165 min，同我們前期對分枝桿菌噬菌體LEO、chy1、BO4一步生長曲線類似[18-20]，較以往報道過碳青霉烯類鮑曼不動桿菌噬菌體[21]和鼠疫菌噬菌體[22]的生長周期長。分枝桿菌噬菌體潛伏期長，可能是因宿主菌增殖慢導(dǎo)致。張劼等研究者[21]認(rèn)為噬菌體裂解量大的，能產(chǎn)生更多的子代，有更多的噬菌體侵染未裂解的細(xì)菌。PH值為7的環(huán)境最適合噬菌體DNAⅢ生存，因此DNAⅢ能在人體血液(PH值7.35-7.45)內(nèi)存活、殺菌。人巨噬細(xì)胞溶酶體和內(nèi)吞體的pH值約為5[23]，在該P(yáng)H值環(huán)境中DNAⅢ仍具有殺菌能力，說明胞內(nèi)菌有可能被DNAⅢ裂解。噬菌體DNAⅢ對于23株耐藥MTB臨床分離株，寬噬率高達(dá)78.26%。而且DNAⅢ還能裂解MDR-TB和XDR-TB株。因此DNAⅢ治療耐藥結(jié)核臨床運(yùn)用前景良好。

吸附宿主菌是噬菌體感染宿主的第一步，抗血清可抑制吸附過程。K值越高抗原性越強(qiáng)[7]，DNAⅢ的K值為770.01，比D29的K值(1069.50)低，說明與D29相比機(jī)體更不容易清除DNAⅢ。噬菌體DNAⅢ的抗血清交叉中和實(shí)驗(yàn)說明DNAⅢ與其余8株噬菌體之間無交叉吸附表位。

4 結(jié)論

DNAⅢ潛伏期較短，裂解譜廣，抗原性低，能直接殺滅耐藥MTB，存在殺滅休眠菌及胞內(nèi)菌可能，具有抗耐藥結(jié)核潛力。噬菌體DNAⅢ可作為治療耐藥結(jié)核的噬菌體雞尾酒療法的配方噬菌體。