齊鐵雄 石琳 鄭彤 包敏 劉世華 劉艷

(1.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100020；2.航空總醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100012)

可吸入顆粒物可造成人類的心血管損傷，導(dǎo)致心臟功能降低，引起心血管疾病的發(fā)生率和死亡率增加,檢測心肌損害有多項生化指標(biāo)，肌紅蛋白(myoglobin,Mb)在哺乳動物心肌中含量最高，且被普遍認(rèn)為是影響心肌功能的重要的生化指標(biāo)，是心肌損傷中最早升高的標(biāo)志物之一，具有高度敏感性。腦鈉肽(BNP)是1988年從豬腦中分離出來，主要由心室肌合成并分泌,其合成受到左心室室壁張力和多種神經(jīng)激素作用的調(diào)節(jié),以脈沖方式由冠狀竇釋放入血,主要由腎臟清除[1]。BNP主要作用是抑制交感神經(jīng)的過度反應(yīng)，參與血壓、血容量及鹽平衡的調(diào)節(jié)，從而對調(diào)節(jié)體液和血壓起到重要作用[2]，被認(rèn)為是一種有意義的心臟病學(xué)標(biāo)志物[3]，Tsutamoto等[4]發(fā)現(xiàn)，腦鈉肽是最好的評價心力衰竭預(yù)后的神經(jīng)激素標(biāo)志物。但僅根據(jù)單一標(biāo)志物診斷效果不佳，需聯(lián)合應(yīng)用Mb和BNP可結(jié)合它們不同的診斷優(yōu)勢，提高診斷效能，對心臟疾病的診斷具有至關(guān)重要的意義[5]。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及設(shè)備 選用70只清潔級雄性成年SD大鼠；體質(zhì)量(150±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。室溫22～28℃下飼養(yǎng)，濕度50%～60%，自然光照周期，實驗過程均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。采用KL1-e411型全自動化學(xué)發(fā)光儀(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，RaytoRT-6100酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)，Mb及BNP試劑盒購于南京建成生物工程公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8 試劑盒，碧云天)。

1.2 方法

1.2.1 毒物樣品搜集、提取及大鼠呼吸道滴定液的制備 本實驗使用的濾膜為whatman特氟龍有機(jī)濾膜及Air Metric公司生產(chǎn)的便攜式小流量顆粒物采樣器進(jìn)行采樣。

1.2.2 煙霧箱實驗操作 采用小型室外光化學(xué)煙霧箱。箱內(nèi)氣體由特氟龍管，從箱子一側(cè)的出氣口接出，連接采樣器進(jìn)行膜采樣。采用開放式燃燒室。燃燒室為長方體鐵質(zhì)結(jié)構(gòu)，長5m，寬3m，高2m，底部有一鐵托盤，秸稈及煤在鐵托盤上燃燒。燃燒室上部與排煙管道相連，管道末端有一排氣扇，煙氣在排氣扇的作用下抽出。在煙道管前方有一三通，煙氣通過此三通進(jìn)入箱體。實驗開始時，打開三通末端煙氣進(jìn)氣泵，分別鼓入汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣四種污染源氣體。當(dāng)煙霧箱內(nèi)顆粒物濃度達(dá)到300 ug/m3并穩(wěn)定時，停止鼓入煙氣，關(guān)閉箱體，顆粒物采樣器開始通過濾膜采集樣品。稱重后加水超聲溶解，配成1mg/ml濃度的顆粒物懸液待滴定。

1.2.3 實驗分組 將70只雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為對照組10只、汽車尾氣組15只、煤煙組15只、燃燒秸稈組15只和自然空氣組15只。實驗組按1mg/ml的相同的濃度氣管內(nèi)分別滴注汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣顆粒的懸液每天1次，一次0.1ml，連滴10天；按0、2、4、6、8和10天6個時間點取大鼠眶靜脈血清。在達(dá)到觀察終點后處死全部大鼠，稱體重(bodymass,BM)后，無菌進(jìn)行解剖摘取心臟，稱心臟質(zhì)量(heartmass,HM)，肉眼觀察心臟表觀情況；計算HM/BM;將心臟組織左室用于病理學(xué)檢測(10%中性福爾馬林溶液固定)，石蠟包埋、切片，HE染色。病理分析光鏡下進(jìn)行觀察并拍照。鏡下觀察各組大鼠心肌組織炎性細(xì)胞浸潤、心肌組織損傷、壞死、心肌纖維化等病理改變情況。采用CCK-8法檢測大鼠心肌細(xì)胞的存活率。細(xì)胞計數(shù)將含2×103個細(xì)胞/孔(約100接種于96孔板，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，向每個細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入10mlCCK8溶液，避光孵育14小時，以酶標(biāo)儀測量波長450nm處吸光度值。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)5次。

1.3 觀察指標(biāo) 每天觀察記錄大鼠的飲食及體重、活動力、糞便情況，觀察毛發(fā)、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等情況，按6個時間點觀察并記錄大鼠一般情況及生存情況，記錄各時間點大鼠生存數(shù)。取大鼠眶靜脈血清，采用化學(xué)發(fā)光法分別檢測5組的心損標(biāo)志物肌紅蛋白(Mb)和腦鈉肽(BNP)水平的變化。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗開始后6個時間點肌紅蛋白(Mb)水平變化 汽車尾氣組、煤煙組和自然空氣組肌紅蛋白(Mb)水平滴入毒物2d后開始升高, 高于其它各組(P<0.05)，三組間無顯著性差異(P>0.05)；滴入毒物的4d達(dá)到峰值,發(fā)病的8d逐漸恢復(fù)至正常值。燃燒秸稈組肌紅蛋白(Mb)水平滴入毒物4d后開始升高, 高于對照組，有顯著性差異(P<0.05)；滴入毒物的6d達(dá)到峰值,發(fā)病的10d逐漸恢復(fù)至正常值，見表1。

表1 各實驗組肌紅蛋白(U/L)水平的動態(tài)變化Table 1 The dynamic changes of myoglobin in each experimental group

2.2 各實驗組6個時間點腦鈉肽水平變化 汽車尾氣組、煤煙組和自然空氣組腦鈉肽 (BNP)水平在滴入毒物4d后開始升高, 高于其它各組(P<0.05)，三組間無顯著性差異(P>0.05)；滴入毒物的6d達(dá)到峰值,滴入的10d逐漸恢復(fù)至正常值。燃燒秸稈組腦鈉肽 (BNP)水平滴入毒物4d后開始升高, 高于對照組，有顯著性差異(P<0.05)；滴入毒物的6d達(dá)到峰值,在其發(fā)病的10d逐漸恢復(fù)至正常值，見表2。

表2 各實驗組腦鈉肽(BNP)(pg/ml)水平的動態(tài)變化Table 2 Dynamic changes of brain natriuretic peptide levels in each experimental group

2.3 各實驗組HM/BM和心肌細(xì)胞存活率比較 汽車尾氣組HM/BM明顯升高(P<0.05)，有10例心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞浸潤、水腫、變性。5例出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；煤煙組HM/BM明顯升高(P<0.05)，有9例心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞浸潤、水腫、變性。6例出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；自然空氣組HM/BM明顯升高(P<0.05)，有9例心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞浸潤、水腫、變性；6例出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；三組心肌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，均低于秸稈組和對照組；但三組間無顯著性差別(P>0.05)；秸稈組大鼠HM/BM變化不明顯(P>0.05)，心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞水腫、變性，HM/BM無明顯升高(P<0.05)，心肌細(xì)胞存活率下降不明顯(P>0.05)，見表3。

表3 各實驗組HM/BM和心肌細(xì)胞存活率Table 3 HM/BM and cardiomyocyte survival rate in each experimental grou

3 討論

實驗中，我們選擇了血清肌紅蛋白(Mb)和腦鈉肽 (BNP)作為判斷大鼠心肌損害檢驗指標(biāo)。肌紅蛋白(Mb)存在于哺乳動物Ⅰ型、Ⅱa型骨骼肌或心肌組織細(xì)胞質(zhì)中，是一種重要的細(xì)胞內(nèi)色素蛋白。有研究表明[6]，Mb能夠促進(jìn)組織內(nèi)的氧供應(yīng)，具有氧轉(zhuǎn)運載體、細(xì)胞內(nèi)催化劑和氧儲存等功能，在參與心肌和骨骼肌細(xì)胞的氧供應(yīng)和氧消耗中發(fā)揮重要作用[7]，在心肌損傷的早期釋放入血。Mb在血中出現(xiàn)早與其分子量很小有關(guān)，能迅速自損傷部位釋放進(jìn)入血液循環(huán)，從而使血清中肌紅蛋白的水平明顯升高。有實驗表明，缺氧環(huán)境下的MbKO小鼠心臟功能障礙是有NO介導(dǎo)的，從而間接證明Mb具有細(xì)胞內(nèi)NO水平調(diào)控作用[8]。腦鈉肽(BNP)是生理和病理狀況下維持心腎系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)?？膳c其受體結(jié)合，刺激鳥苷酸環(huán)化酶而抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的縮血管作用，抑制交感神經(jīng)的過度反應(yīng)，降低血漿腎素和醛固酮的濃度，促進(jìn)血管的松弛，在容量負(fù)荷過多的時候產(chǎn)生利鈉、利尿、血管擴(kuò)張、血壓下降的效應(yīng)[9-11]，當(dāng)心室負(fù)荷改變和心肌受牽張及心肌受到損傷時，BNP合成和分泌增加，并大量釋放進(jìn)入血液[12]。有研究認(rèn)為，輕度牽拉心室即可使BNP的mRNA表達(dá)增高，合成增多，當(dāng)出現(xiàn)心功能不全時，心室腦鈉肽mRNA快速轉(zhuǎn)錄，突發(fā)性合成BNP，表明BNP可以作為左室功能障礙敏感性和特異性的指標(biāo)[13-14]，且BNP釋放與心室擴(kuò)張和壓力負(fù)荷成正比[15-16]。BNP也是缺血標(biāo)志物，即使沒有心肌壞死的情況下，心肌缺血也能使BNP水平升高。Mukoyama等[17]報道，慢性心力衰竭患者血漿腦鈉肽水平較正常升高，且與心衰嚴(yán)重程度呈正比。Chang等[18]進(jìn)一步提出BNP及其前體作為心力衰竭標(biāo)記物，其診斷價值明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的診斷方法。在鑒別心力衰竭與其他原因引起的呼吸困難時，腦鈉肽水平的升高比左心室射血分?jǐn)?shù)和心鈉肽、N末端殘片腦鈉肽更準(zhǔn)確及敏感，其敏感度>90%，其特異性為80～90%[19-20]。BNP在心臟功能受損時會顯著增大分泌量和加快分泌速度，能有效調(diào)節(jié)血容量和心臟功能。因此,BNP可能有助于保護(hù)心功能[21-22]。BNP還能減少血管收縮肽產(chǎn)生而促進(jìn)血管舒張肽的釋放從而抗冠狀動脈痙攣，可使血管平滑肌松弛，降低血壓，減輕心臟的前負(fù)荷；抑制心肌細(xì)胞纖維化、血管平滑肌細(xì)胞增生以及纖維化；抗心肌細(xì)胞脂肪分解、抗心肌成纖維細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖，抑制心肌細(xì)胞肥大、增生；抑制某些激素的活性；此外，還參與凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)調(diào)節(jié)，減少內(nèi)皮功能損傷。腦鈉肽清除有兩種途徑：結(jié)合受體或通過中性內(nèi)肽酶(neutral endopeptidase NEP)使其滅活[23]。研究中還發(fā)現(xiàn):各研究組大鼠血清肌紅蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(BNP)的水平均明顯高于對照組大鼠,二者相比差異具有顯著性。各研究組大鼠血清中Mb的水平在其滴入毒物后均有升高，均在一定時間內(nèi)達(dá)到峰值,在實驗期間逐漸恢復(fù)至正常值。血清中BNP水平也存在此類波動變化，BNP達(dá)到峰值的時間及逐漸恢復(fù)至正常值的時間比Mb水平晚，但升高的幅度更高。汽車尾氣組、煤煙組和自然空氣組大鼠引起的心肌損害最嚴(yán)重，而汽車尾氣的主要成分是一氧化碳、碳?xì)浠衔?、氮氧化物、二氧化硫和一些重金屬；煤煙的主要成分是碳、氫、氧、氮及硫、磷、氟、氯和砷；自然空氣組的主要成分為硫酸鹽、硅酸鹽、硝酸鹽及多種重金屬的混合物；說明這些物質(zhì)引起的心肌細(xì)胞損傷較強(qiáng)；燃燒秸稈組引起心肌細(xì)胞損傷較弱；以上三組均出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；HM/BM明顯升高；心肌細(xì)胞存活率明顯降低。而燃燒秸稈的主要成分是碳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂，說明這些成分造成的心肌細(xì)胞損害較弱。心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞水腫、變性，HM/BM無明顯升高(P<0.05)，心肌細(xì)胞存活率下降不明顯(P>0.05)。

4 結(jié)論

本資料顯示，氣管內(nèi)滴入汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣顆粒的大鼠，血清中肌紅蛋白和腦鈉肽水平明顯升高。高濃度的汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣顆粒均可以引起心肌損害，參與了心肌損害過程。檢測大鼠血清中肌紅蛋白和腦鈉肽的水平對判斷污染物對大鼠心肌損害程度具有重要意義。