李秀良，李芳玉，曹艷紅，吳柱月，黨瑞華，李紹波，陳 宏，雷初朝*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100)

中國黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛兩個牛種，二者的共同祖先是原牛[1]。作為世界牛品種資源寶庫的重要組成部分，我國地方黃牛品種具有豐富的遺傳多樣性。1986年，邱懷[2]在《中國牛品種志》將中國黃牛整理分類后分成了28個地方黃牛品種，同時按照地理分布區(qū)域的不同，把中國黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛3大類。潿洲牛的中心產(chǎn)區(qū)在廣西北海市的潿洲和斜陽兩島，其中潿洲島的牛群約占總數(shù)的96%，斜陽島占4%，在北海市及合浦縣等地區(qū)也有少量分布。潿洲牛經(jīng)過產(chǎn)區(qū)風土馴化，具有體型飽滿、耐熱和耐粗飼、適應(yīng)性強、繁殖率高、屠宰率高等優(yōu)點。隨著潿洲島旅游開發(fā)力度加大，為了符合市場經(jīng)濟發(fā)展的需要，潿洲牛作為役用逐漸減少，更多的作為肉用[3]。

Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)兩部分組成，其中MSY區(qū)在減數(shù)分裂時不與X染色體發(fā)生重組[4]，具有父系遺傳特性，且Y染色體的單倍型完整，具有較低的突變率，不易受重組和回復突變等因素影響，是探明父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史等研究的理想工具[5]。根據(jù)以往的一些研究發(fā)現(xiàn)，家牛具有Y1、Y2和Y3三種單倍型組，其中Y1和Y2單倍型組代表普通牛起源，而Y3單倍型組為瘤牛起源[6,7]。利用位于Y染色體MSY區(qū)的單核苷酸多態(tài)性標記(Y-SNPs)可以確定家牛的Y染色體單倍型組[6]，利用微衛(wèi)星標記(Y-STRs)，可以更精確地反映3種單倍型組內(nèi)豐富的Y染色體單倍型[8,9]，將這兩種標記結(jié)合起來使用可以更完整地反映Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)。

Zhang等[10]利用5個Y-SNPs(ZFY-9、ZFY-10、DDX3Y-7、DDX3Y-1和UTY-19)標記對4個中國地方牛品種共96個雄性個體進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5個Y-SNPs標記能夠?qū)⑵胀ㄅ：土雠^(qū)分開來。Cai等[11]對25個中國地方黃牛品種共423頭個體的2個Y-STRs(UMN2404和UMN0103)標記進行基因分型和多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)這兩個位點具有明顯的多態(tài)性，可以區(qū)分普通牛和瘤牛血統(tǒng)。迄今為止，尚未見到有關(guān)潿洲牛分子水平上的Y染色體遺傳多樣性及父系起源的報道。因此，本研究利用2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)及2個Y-STRs標記(INRA189和BM861)對28頭潿洲牛公牛進行多態(tài)性檢測，通過分析潿洲牛Y染色體的單倍型組成，來探明該群體的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在廣西壯族自治區(qū)潿洲島保種場采集潿洲牛28頭公牛的耳組織，低溫保存帶回實驗室，采用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增

參照Gotherstrom等[12]和Ginja等[8]報道的2個家牛Y-SNPs標記(即UTY-19和ZFY-10)以及Edwards等(2011)的研究中的Y-STRs標記(INRA189和BM861)合成四對引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μLPCR體系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海寶生物公司)12.5 μL，上、下游引物 (10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，Ta℃(見表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35個循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.3 PCR產(chǎn)物測序、分型及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序和分型，利用DNASTAR 7.1(DNASTAR, Madison, WI, USA)軟件對Y-SNPs測序結(jié)果進行統(tǒng)計，利用GeneMarker V1.91軟件對Y-STRs分型結(jié)果進行查看和校正。利用Y-SNPs的2個標記先確定家牛的單倍型組，繼而結(jié)合Y-STRs的2個標記的分型結(jié)果，二者共同確定出每頭黃牛的Y染色體單倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。最后使用Arlequin 3.0軟件計算群體單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

通過對28頭潿洲牛公牛的2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)的測序分析，并參考Gotherstrom等[12]和Ginja等[8]對家牛Y染色體單倍型組的判定標準，結(jié)果表明：這兩個Y-SNPs標記在28頭潿洲牛中均具有多態(tài)性，其中UTY-19標記發(fā)現(xiàn)一個C>A 核苷酸顛換，在ZFY-10標記發(fā)現(xiàn)1個C>T核苷酸轉(zhuǎn)換和1個GT插入/缺失，表明28頭潿洲牛只包含Y3一種單倍型組。對2個Y-STRs標記(INRA189和BM861)進行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示：INRA189有兩種等位基因，大小分別為88 bp和90 bp，而BM861只有一個156 bp的等位基因。結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標記確定潿洲牛的單倍型為Y3-88-156和Y3-90-156(表2)，頻率分別為89.29%(25/28)和10.71%(3/28)，表明潿洲牛只有1個瘤牛父系起源。潿洲牛群體的單倍型多樣度為0.1984±0.0924，表明父系遺傳多樣性很低。

表1 家牛2個Y-SNPs位點及2個Y-STRs位點的名稱、位置、退火溫度與引物序列

表2 潿洲牛Y染色體單倍型與單倍型頻率

3 討論

Y染色體分子遺傳多樣性是研究動物父系起源和群體遺傳多樣性的重要工具。近年來，Y-SNPs標記和 Y-STRs標記被廣泛應(yīng)用于動物Y染色體遺傳多樣性研究[6-9]，將這兩種標記結(jié)合起來使用可以更精確地反映Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)。近幾年來，國內(nèi)外越來越多的研究已經(jīng)將二者結(jié)合起來分析黃牛群體的Y染色體遺傳多樣性和父系起源[8]。潿洲牛是廣西自治區(qū)優(yōu)良的地方品種，目前為止，關(guān)于潿洲牛的分子水平上的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和父系起源的研究未見報道。

中國黃牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩種父系起源，普通牛在中國北方地區(qū)占優(yōu)勢，瘤牛主要分布在南方地區(qū)，中原地區(qū)為二者交匯處[6]。本研究結(jié)果表明潿洲牛只有一個Y3單倍型組，說明潿洲牛只有1個瘤牛父系起源，潿洲牛分布在南方地區(qū)，與常振華等[6]研究結(jié)論相符合。夏小婷等[13]對32頭關(guān)嶺牛的Y-SNPs(USP9Y基因)和2個STRs標記(INRA189和BM861)進行遺傳性分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)嶺牛以瘤牛Y3父系起源為主，還具有普通牛Y2父系起源。侯佳雯等[14]利用2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)和2個Y-STRs標記(INRA189和BM861)對35頭皖南公牛進行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皖南牛具有Y1、Y2和Y3 3種單倍型組，以瘤牛Y3父系起源為主，其中Y1單倍型組可能是由外來牛品種的雄性基因滲入所致[7]。李芳玉等[15]利用2個Y-SNPs標記(UTY-19和ZFY-10)和2個Y-STRs標記(INRA189和BM861)，發(fā)現(xiàn)49頭大別山牛全部為Y3-88-156單倍型，表明該品種只有Y3瘤牛父系起源，其遺傳多樣性很低，表明其瘤牛種質(zhì)特性單一、穩(wěn)定。關(guān)嶺牛、皖南牛、大別山牛與潿洲牛都為南方黃牛，其中潿洲牛只有Y3單倍型組而不具有Y1和Y2單倍型組，說明潿洲牛和大別山牛一樣，只有一個瘤牛父系來源，血統(tǒng)單一，沒有受普通牛Y2的影響，也不存在外來牛品種的雄性基因滲入現(xiàn)象，其遺傳資源保存較好。

單倍型多樣度是衡量一個群體變異程度的重要指標。目前在分子水平上尚未見到有關(guān)潿洲牛單倍型多樣度的報道，本研究中28頭潿洲牛的Y染色體單倍型多樣度為0.1984±0.0924，低于我國16個黃牛品種的Y染色體單倍型多樣度的平均值[7]。說明潿洲牛的父系遺傳多樣性較低。潿洲牛是役肉兼用型黃牛地方品種，潿洲島和斜陽島與內(nèi)陸有大海相隔，長期以來，潿洲牛都是本品種自然交配進行純種繁殖。公牛的選育多采用選優(yōu)去劣的方法，大部分公牛被閹割，只留少數(shù)做種用，可能是導致本品種的遺傳多樣性較低的原因。這也說明潿洲牛品種的遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定，品種較純。近年來，潿洲牛群體數(shù)量有逐年下降的趨勢，該品種處于瀕危維持狀態(tài)[3]，因此，應(yīng)當加大潿洲牛保種開發(fā)力度，建立健全潿洲牛保種體系，使得這一優(yōu)良的種質(zhì)資源得以保護和開發(fā)利用。