史紅俠，姚一博，夏小婷，呂 忠，黨瑞華，藍(lán)賢勇，陳 宏，雷初朝,*

(1. 渭南市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 渭南，714000；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技系統(tǒng)，陜西 楊凌，712100；3. 國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系延邊綜合試驗(yàn)站，吉林 延邊 133000)

哺乳動(dòng)物Y染色體的絕大部分區(qū)域?yàn)榉侵亟M區(qū)，也稱(chēng)雄性特異區(qū)(MSY區(qū))，其突變率低，不容易受到重組和回復(fù)突變的影響，并且遵循父系遺傳，是研究動(dòng)物遺傳多樣性、父系起源和馴化歷史的理想工具。國(guó)內(nèi)外學(xué)者基于Y染色體單核苷酸多態(tài)性 (Y-SNPs) 和微衛(wèi)星 (Y-STRs) 分子標(biāo)記，對(duì)家牛 (包括普通牛和瘤牛) 進(jìn)行了較為系統(tǒng)的父系遺傳研究，結(jié)果表明家牛包含普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3單倍型組。利用Y-SNPs標(biāo)記可區(qū)分家牛的3種單倍型組，利用Y-STRs標(biāo)記可精細(xì)區(qū)分各單倍型組內(nèi)的不同單倍型[1]。

延邊牛是我國(guó)五大地方良種黃牛之一。吉林省延邊朝鮮族自治州是延邊牛的主要產(chǎn)區(qū)，主要分布于圖們江流域和海蘭江流域的延吉市、龍井市、圖們市和琿春市等地。延邊牛是延邊各族人民精心選育的品種，早在清道光年間(1821-1850)，中國(guó)人民和朝鮮人民就有往來(lái)，隨著朝鮮移民遷入，將朝鮮牛輸入我國(guó)東北地區(qū)，經(jīng)與本地黃牛雜交、改良培育出適合延邊地區(qū)自然條件的延邊牛。延邊牛耐寒、耐粗飼、抗病能力強(qiáng)，具有遺傳性能穩(wěn)定、役用性能強(qiáng)、肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，是培育我國(guó)專(zhuān)門(mén)化肉牛品種的良好資源，有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛質(zhì)，市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景廣闊[2]。

目前，國(guó)內(nèi)研究者對(duì)中國(guó)黃牛群體遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)及起源的研究主要集中在mtDNA和Y染色體分子標(biāo)記方面[3-11]。王朝鋒等[3]通過(guò)對(duì)延邊牛mtDNA D-loop序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)延邊牛為普通牛母系起源。然而，關(guān)于延邊牛的父系遺傳多樣性及遺傳背景的研究報(bào)道相對(duì)較少[9]。因此，本研究利用Y染色體經(jīng)典特異性分子標(biāo)記Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)對(duì)32頭延邊牛的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析單倍型組成和單倍型多樣度來(lái)探究延邊牛的群體結(jié)構(gòu)和父系起源，為開(kāi)展該品種的分子育種和資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

從吉林省延邊州延邊牛國(guó)家遺傳資源保種場(chǎng)采集32頭延邊牛公牛耳組織于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎没蚪MDNA提取試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

1.2.1 UTY19和ZFY10基因的合成、PCR擴(kuò)增 參照已發(fā)表的家牛Y染色體UTY19、ZFY10標(biāo)記引物信息[8]合成2對(duì)Y-SNPs引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL：上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。將合格PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 熒光微衛(wèi)星引物的合成與PCR擴(kuò)增 參照Edwards等[1]報(bào)道的分型方法合成2對(duì)熒光Y-STRs引物(INRA189和BM861)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，其中上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，Ta℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用2.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司分型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過(guò)2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記的判定結(jié)果(表1)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記的分型結(jié)果[1]，確定每頭黃牛的Y染色體單倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。用ARLEQUIN V3.11軟件計(jì)算單倍型頻率和單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 延邊牛Y-SNPs多態(tài)性

對(duì)延邊牛UTY19和ZFY10基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)2個(gè)標(biāo)記在32頭延邊牛中均具有多態(tài)性：在UTY19標(biāo)記上發(fā)現(xiàn)1個(gè)C>A顛換，在ZFY10標(biāo)記上發(fā)現(xiàn)一個(gè)GT插入/缺失位點(diǎn)(表1)。參照Li等[10]對(duì)家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，32頭延邊牛中僅有1頭屬于Y1單倍型組，其余31頭均屬于Y2單倍型組，Y1和Y2單倍型組個(gè)體所占頻率依次為0.031和0.969，表明所有的延邊牛均屬于普通牛起源。

2.2 延邊牛Y-STRs多態(tài)性

延邊牛2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)的檢測(cè)結(jié)果表明，在INRA189座位中共檢測(cè)到3個(gè)等位基因，大小分別為98 bp、102 bp和104 bp，所占個(gè)體數(shù)為1、30、1，其中98 bp對(duì)應(yīng)Y1單倍型組，102 bp和104 bp對(duì)應(yīng)Y2單倍型組。而在延邊牛的BM861座位中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，僅檢測(cè)到158 bp一種等位基因。

表1 延邊牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)

2.3 延邊牛Y染色體單倍型頻率和單倍型多樣度

根據(jù)Edwards等[1]報(bào)道的Y-SNPs標(biāo)記與Y-STRs標(biāo)記結(jié)合的單倍型分型方法，對(duì)32頭延邊牛的單倍型進(jìn)行分析(Y-SNP-INRA189-BM861)，共確定3種單倍型，其中1頭為Y1單倍型(Y1-98-158)，30頭為Y2單倍型(Y2-102-158)，剩下的1頭為Y2單倍型(Y2-104-158)。3種Y染色體單倍型頻率分別為0.031，0.938和0.031。延邊牛Y染色體單倍型多樣度為0.1230±0.0777。

3 討論

動(dòng)物Y染色體分子遺傳標(biāo)記是目前研究父系起源的重要工具。大量的研究表明[1, 5-8, 10, 11]，家牛共有3種Y染色體單倍型組，分別是普通牛Y1和Y2單倍型組，瘤牛Y3單倍型組。Edwards等[1]利用Y-SNPs和Y-STRs分子標(biāo)記分析了歐洲和亞洲共138個(gè)牛品種，結(jié)果表明Y1單倍型組主要分布在歐亞大陸北部，Y2單倍型組主要分布在中東和歐洲南部地區(qū)，Y3單倍型組則主要集中在東南亞地區(qū)。中國(guó)是世界上黃牛品種資源最豐富的國(guó)家之一，目前我國(guó)有53個(gè)地方黃牛品種[2]。按地理分布區(qū)域的不同，中國(guó)黃?？梢苑譃楸狈近S牛、中原黃牛和南方黃牛三大類(lèi)。關(guān)于中國(guó)黃牛的起源、進(jìn)化和遺傳多樣性，國(guó)內(nèi)學(xué)者在Y染色體分子遺傳多態(tài)性[5- 11]及線粒體DNA多態(tài)性[3-4, 6]等方面做了大量研究，結(jié)果均支持我國(guó)黃牛為多元起源的觀點(diǎn)，普通牛主要影響北方黃牛，瘤牛主要影響南方黃牛，而中原地區(qū)的黃牛同時(shí)受到普通牛和瘤牛的影響。

常振華等[11]和Li等[10]先后對(duì)16個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的Y染色體遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和起源進(jìn)行分析，結(jié)果均表明北方黃牛以Y2單倍型組為主，南方黃牛以Y3單倍型組為主，中原黃牛包含普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)少量黃牛品種(哈薩克牛、秦川牛、吉安牛)中含有少量的Y1單倍型組。Cai等[9]分析了25個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(UMN2404和UMN0103)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)延邊牛與安西牛、西藏牛、蒙古牛同屬普通牛父系起源。本研究采用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY19和ZFY10)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)結(jié)合的單倍型分型方法[1]，確定延邊牛有3種Y染色體單倍型(Y1-98-158、Y2-102-158和Y2-104-158)，其中Y2-102-158單倍型占主導(dǎo)地位(93.8%)，說(shuō)明延邊牛是以Y2單倍型組為主的普通牛父系起源。按照地理分布延邊牛屬于北方黃牛，本研究結(jié)果與Cai等[9]、Li等[10]和常振華等[11]的研究結(jié)果一致。中國(guó)黃牛中少量Y1單倍型組的檢測(cè)可能與國(guó)外引進(jìn)牛品種的基因滲入有關(guān)[10]。

單倍型多樣度通常被用來(lái)衡量一個(gè)群體的變異程度，單倍型多樣度越高的群體遺傳多樣性越高，遺傳資源越豐富。在本研究中，32頭延邊牛的單倍型多樣度為0.1230±0.0777。而Edwards等[1]報(bào)道的138個(gè)國(guó)外牛品種的單倍型多樣度平均值為0.422±0.3，Li等[11]分析的中國(guó)16個(gè)黃牛品種的單倍型多樣度平均值為0.6831±0.0134，均大于本研究中32頭延邊牛的單倍型多樣度，表明延邊牛Y染色體單倍型多樣度和分子遺傳多樣性較低。這可能是由于延邊牛群體所處的地理位置偏北方，缺乏與其他牛群體的基因交流，父系起源單一，導(dǎo)致該群體較低的單倍型多樣度。同時(shí)也說(shuō)明延邊牛品種內(nèi)純度高，品種資源遺傳穩(wěn)定。