靳欣欣，潘立剛，李 安

（北京農業(yè)質量標準與檢測技術研究中心/農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗室，北京 100097）

俗話說，民以食為天，隨著人們生活水平的提高，農產品安全也成為社會輿論關注的熱點。隨著安全事件頻發(fā)及國家有關方面的重視，對農產品檢測技術的要求也越來越高，作為近年來發(fā)展較快的檢測技術。穩(wěn)定同位素質譜具有高靈敏度、低檢測限的特點，在農品產地溯源及摻雜、鑒別中應用越來越廣泛。其獨特的原理也使其獲得獨特的應用優(yōu)勢，如葡萄酒中摻入甘油，單花蜜中摻入雜花蜜等摻假鑒別；有機食品與非有機食品的鑒別等。

穩(wěn)定同位素技術一直主要應用于產地溯源和摻雜判別，近年來關于農田環(huán)境中有機污染物的來源追溯、降解機理、轉化途徑及量化轉化程度方面的研究也在陸續(xù)開展。

1 穩(wěn)定同位素質譜的基本原理概述

相同元素的原子中，由于原子核含有的中子數(shù)目不同，這些原子被稱為同位素，其中包括穩(wěn)定同位素和放射性同位素。穩(wěn)定同位素，不具有放射性，在研究中比較安全，針對穩(wěn)定同位素的檢測的應用也日益廣泛[1]，如1H和2H，12C和13C，16O、17O和18O。

穩(wěn)定同位素質譜（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）即所檢測的樣品中目標元素穩(wěn)定同位素的豐度（以原子百分計的同位素的相對含量）。在自然界中，生物體與其所在環(huán)境會進行物質交換，其同位素組成會因此發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱為同位素分餾，也是造成不同來源物質中同位素差別的原因，可以視為外界環(huán)境對生物體打下的特征印跡[2]。利用該原理，IRMS技術可以開展來源追溯、降解機理、轉化途徑及量化轉化程度等方面的研究。在具體的測定中，使用國際公用的參照標準物的相對量來表示同位素的富集程度，表達式[3]為：

式（1-1）和（1-2）中，δ‰表示穩(wěn)定同位素的比率，R樣品表示測定樣品中重同位素和輕同位素豐度比，R標準表示國際標準樣品中重同位素和輕同位素豐度比。

表1 常見同位素的分餾原因及其在食品溯源中的應用

2 穩(wěn)定同位素技術在產地溯源和有機判別中的應用

不同產地和生長環(huán)境的農產品，在生長過程中受不同的外界環(huán)境影響，吸收不同來源的營養(yǎng)物質，這些都會使農產品發(fā)生同位素分餾，產生具有產地特性的特征值，也是進行產地溯源及真?zhèn)舞b別的基本原理。常應用的幾種同位素的分餾原因及其指示信息[3]見表1。

在穩(wěn)定同位素技術中，產地溯源和摻雜鑒別在農產品安全中應用最為廣泛，技術上也相對成熟，已有大量相關文獻進行綜述。在有機和非有機蔬菜生產中的應用也已有廣泛報道。

有機食品是國際上對天然、無污染食品統(tǒng)一的名稱，通常來自于有機農業(yè)生產體系，根據(jù)國際有機農業(yè)生產要求和標準生產加工。對于有機食品的認證要求中包括生產基地在3年內未使用過農藥、化肥等違禁物質，這點與傳統(tǒng)農業(yè)大多使用化學合成肥料不同，后者可以根據(jù)植物不同生長階段的需求提供其可以利用的營養(yǎng)元素；因此，二者在肥料使用上差異較大，也正是這種不同的種植方式奠定了有機食品鑒別技術的基礎[4]。

IRMS法檢測H、C、N、O、S這些在植物組織中大量存在的元素，精密度可達0.01%～0.20%，且前處理過程較為簡單；其中，研究認可δ15N可作為植物不同肥料管理的研究參數(shù)，其被視為有機食品確證的潛在標記物[5]。

李光德等[6]分析了北京郊區(qū)5個有機和1個常規(guī)蔬菜生產基地的蔬菜和土壤樣品，對其δ15N值進行了測定并找尋規(guī)律特征，結果表明：有機生產時間和有機肥中氮投入增加，土壤全氮和δ15N都有一定的增加，且當季農作物對于肥料中δ15N反應敏感，通過研究發(fā)現(xiàn)δ15N可作為蔬菜是否使用了化學合成氮肥檢測的“有效工具”，但同時應結合生產記錄等措施進行綜合判定。姚志鵬等[7]研究了不同施肥條件下土壤和萵苣不同部位的同位素特征變化情況，設置條件包括施有機肥、尿素和局部施尿素，結果發(fā)現(xiàn)：各肥料條件下土壤δ15N值與萵苣δ15N值的差異及變化規(guī)律為先升后降再趨平，但萵苣不同部位δ15N則存在一定規(guī)律性；總體上，萵苣內葉和土壤δ15N值變化可以作為有機蔬菜種植過程中氮肥的使用種類的鑒別指標。除了δ15N，δ18O也可被結合利用測定二維同位素值來進行鑒別。Mihailova等[8]發(fā)現(xiàn)，在生菜、番茄、馬鈴薯的種植中，施用有機肥料的δ15N較化學合成肥料的δ15N為高，而δ18O則明顯為低，這種氮氧二維同位素的鑒別方法準確度可達84.8%。

3 穩(wěn)定同位素在農田環(huán)境中的應用

因為農田環(huán)境的復雜性，穩(wěn)定同位素技術的應用受到限制，單體同位素分析（Compound-Specific Isotope Analysis，CSIA）及更進一步的二維（2-D CSIA）到多維（MD CSIA）單體同位素分析技術拓展了其在該領域的應用范圍。

CSIA技術是20世紀90年代發(fā)展成熟的一門現(xiàn)代化分析技術[9]，是將氣相色譜與穩(wěn)定同位素質譜儀聯(lián)用，利用了色譜的分離能力，將樣品中的目標化合物分離之后再進行同位素檢測，被檢測的同位素可以是一種元素，也可以是2種或多種元素，即為二維單體同位素分析和多維單體同位素分析。CSIA技術能測定單個化合物中特定元素的同位素比率組成，不會受其他化合物干擾，大大提高了測定結果的可靠性，然而農田環(huán)境的復雜性仍可能造成目標化合物的濃度與被測單體同位素改變的非線性波動，其濃度減小并不意味著目標物的消除，引起濃度變化的原因也不能夠肯定[10]，而2-D CSIA和MD CSIA可進一步克服這個缺陷。

3.1 來源追溯

有機化合物進入環(huán)境中時有自己的特征同位素組成，在特定的環(huán)境領域，若化合物同位素組成保持不變，可直接利用其同位素組成進行來源示蹤[11]。某些有機化合物的同位素組成在環(huán)境中會發(fā)生規(guī)律性的變化，反應物中由輕同位素（12C）形成的分子鍵的鍵力較弱，反應速率高于由重同位素（13C）形成的分子，導致在生成物中的重同位素逐漸富集（偏正），而反應物的重同位素逐漸貧化（偏負）[12]。以此可進行農田環(huán)境污染物的來源追溯。

農業(yè)流域非點源污染[13]主要為農村生活和農業(yè)生產中產生的呈非點狀形式擴散和排放的污染物，其對水域造成的污染問題的日益突出已使農村污染河網水系水質的提升及水體修復被國家列為當前流域管理和農村可持續(xù)發(fā)展的主要工作方向之一[14]，要解決這一問題，需要對農業(yè)流域進行有效管理，并解析污染來源。

硝態(tài)氮是農業(yè)流域的一大類污染源，基于15N-18O雙穩(wěn)定同位素的硝酸鹽追溯技術是目前的主流方向。Harden等[15]通過在美國農業(yè)小流域開展有機肥和傳統(tǒng)化肥對流域水質影響差異的試驗，結果表明：施加有機肥所在流域水體硝酸鹽的δ15N高于施加傳統(tǒng)化肥的δ15N，但硝酸鹽的δ18O并無明顯差異。Liu等[16]則是發(fā)展了15N-17O-18O三穩(wěn)定同位素法，強化了對于黃河水體硝酸鹽來源的解析能力，結果表明：黃河中的硝酸鹽污染源7%來源于未經處理的大氣，陸源污染則在不同流域有不同的主要污染來源。Lu等[17]結合15N-18O的穩(wěn)定同位素值與貝葉斯模型（SIAR）研究了三江平原農業(yè)集約化對于水體污染源的影響，結果表明：在豐水期污染源主要為化學肥料和土壤氮肥，枯水期污染源主要為糞便和污水。

3.2 降解研究

污染物在進入環(huán)境之后，可通過物理、化學、生物作用自然衰減，包括降解作用與非降解作用兩部分。其中非降解作用包括揮發(fā)、擴散、吸附等，在這一過程中，污染物結構并不發(fā)生變化；降解作用主要指化學和生物降解，在降解過程中會使得污染物化學性質發(fā)生改變[18]，降解作用有從本質上去除污染物的有效作用，其速率是自然衰減消除污染物的關鍵，而通常只有化學鍵的斷開或者形成，才能使有機化合物的同位素產生明顯的分餾[19-20]，CSIA可根據(jù)同位素分餾識別并量化生物降解作用，已成為自然衰減降解監(jiān)測的重要技術。

多環(huán)芳烴是一類環(huán)境中廣泛存在的有毒有機化合物，由2個或以上的苯環(huán)以線性排列、彎曲連接或聚簇狀的方式構成，具有致畸、致癌、致突變的作用[21]。農田土壤中的多環(huán)芳烴主要來源于大氣污染、污水灌溉、污泥等[22]，其微生物降解機理是一大研究熱點。焦杏春等[23]應用單體碳同位素分析技術對農田土壤中的多環(huán)芳烴的植物降解過程進行了定量表征，結論表明：玉米根對土壤的多環(huán)芳烴有一定的清除作用，3環(huán)以下的多環(huán)芳烴更傾向于被降解和清除。將穩(wěn)定同位素標記的目標化合物添加入環(huán)境樣品中，結合分子生物學手段進行微生物群體和個體之間穩(wěn)定同位素的流動的方法稱為穩(wěn)定同位素探針（Stable isotope probing，SIP）技術[24]，應用于研究污染物的微生物降解機理，具有廣闊的發(fā)展前景[25]。Guitierrez等[26]在坦帕灣的藻花上驗證了全標記萘為基質運用的DNA-SIP技術可以從海水中鑒定出萘降解菌。Zhang等[27]則應用DNA-SIP從受污染水域的底泥中鑒定出了3種蒽降解菌。

穩(wěn)定同位素在其他農田污染物降解中的應用有：錢毅光[28]研究了有機氯殺蟲劑六氯環(huán)己烷厭氧條件下降解過程的碳同位素分餾特征與降解機理，并對比分析了六氯環(huán)己烷不同對映異構體的降解特征，驗證了穩(wěn)定同位素分析與對映體同位素分析技術結合使用來研究環(huán)境中有機對映體污染物的微生物降解轉化路徑與機理的有效性。Uhlik等[29]利用DNA-SIP技術對被多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴復合污染的土壤進行了研究，發(fā)現(xiàn)土壤中的苯甲酸鹽降解菌和聯(lián)苯降解菌同樣可以萘為碳源進行代謝，揭示了土壤微生物寬泛的生物降解能力。

3.3 轉化途徑

在有機污染物的轉化過程中，同位素分餾的分餾值大小在很大程度上取決于斷裂或形成鍵的類型以及過渡態(tài)化學鍵斷裂或形成的程度；以δ13C為例，利用瑞利方程來表征反應殘留物與反應起始物的關系。

式（3-1）中，f代表殘留分數(shù)，Cx和Co代表反應殘留物與起始物的同位素值(13C/12C)，ε為降解系數(shù)，α為分餾因子（α=KIE-1），ε=1 000×（α－1）[30]。

Kuder等[31]通過研究并計算出了有機污染物甲基叔丁基醚厭氧降解過程中碳、氫同位素的分餾因子，通過與已知的C-O鍵和C-H鍵數(shù)值相比，斷定出甲基叔丁基醚轉化的第一步是酶促水解C-O鍵斷裂而非C-H鍵斷裂。

由于CSIA評價有機污染物轉化通過污染物的碳、氫信號來判定，而13C、2H在污染物中是平均分布的，只有反應位點的13C、2H具有活性；因此使用具體反應位點的動力學常數(shù)（AKIE）更為準確。

式（3-2）中，εrp為具體反應點AKIE的降解系數(shù)[32]。

Zwank等[33]計算了甲基叔丁基醚厭氧降解過程中碳、氫的AKIE，與預期親核取代反應的AKIE值吻合，表明這一轉化過程屬于SN2反應機理。

4 小結

穩(wěn)定同位素技術憑借其獨特的技術原理，在農產品產地溯源和摻雜鑒別方面中有突出優(yōu)勢與無可替代的地位，針對當前的一些棘手的食品安全事件也可以有效地解決，比如三聚氰胺非法添加奶粉[34]，以及進口橄欖油、中藥材、茶葉等的產地溯源與真?zhèn)舞b別，穩(wěn)定同位素技術均可擴展到不同的應用領域[35]，尤其是現(xiàn)在大熱的有機食品鑒別，為將來研究發(fā)展的一個熱點。

穩(wěn)定同位素在農田環(huán)境方面的應用，包括了污染物溯源、降解研究和轉化機理等，依靠與色譜分離能力結合的單體和多維單體同位素分析技術，極大地擴展了其應用領域并提高了檢測的準確度；同時與其他學科的聯(lián)合應用，包括與分子生物學聯(lián)合的穩(wěn)定同位素探針技術在土壤生物降解方面的應用及在物理化學和反應動力學上探尋污染物轉化機理的應用，其都是未來穩(wěn)定同位素技術發(fā)展的方向。