阮鳴，喻斌，霍光明，張李陽，劉維周

(1.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院、江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點建設(shè)實驗室，江蘇 南京 211171；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

將靈芝菌種接種于黃芪藥渣中進行固體發(fā)酵得到的靈芝菌絲體與黃芪藥渣的發(fā)酵復(fù)合體謂之芝芪菌質(zhì)。其中的黃芪藥渣的化學(xué)成分為靈芝真菌的生長提供營養(yǎng)，而靈芝真菌的酶又可改變黃芪藥渣的組織和成分，因這種雙向性而被稱為雙向性固體發(fā)酵技術(shù)。雙向性固體發(fā)酵技術(shù)是將藥用真菌發(fā)酵菌種(例如靈芝、槐耳、姬松茸等)和發(fā)酵基質(zhì)(具一定活性成分的中藥材或藥渣)構(gòu)成發(fā)酵組合,雙方相適應(yīng)則在一定條件下進行固體發(fā)酵。

中藥藥材加工為中成藥后剩留大量尚含有各種殘余成分的藥渣，但它大多被廢棄。目前我國藥渣的資源化利用可分為3類，即有效成分的富集提取利用、生態(tài)經(jīng)濟化利用和高附加值化利用[1]。雙向固體發(fā)酵技術(shù)是目前開發(fā)藥渣最有希望的途徑之一，可被用來開發(fā)藥渣，以產(chǎn)生各種有用的藥性菌質(zhì)(藥渣與真菌菌絲發(fā)酵復(fù)合體)，它作為一種新資源可繼續(xù)研發(fā)成新藥或保健品、功能性食品等。

本課題組的前期實驗研究已證實芝芪菌質(zhì)對肉雞、日本沼蝦、中華絨螯蟹、黃顙魚具有顯著的免疫促進作用[2-5]。本實驗?zāi)康氖菫榱颂骄恐ボ尉|(zhì)對人體的免疫促進作用，篩選其免疫活性部位，為黃芪藥渣的二次利用提供理論依據(jù)，為將芝芪菌質(zhì)繼續(xù)研發(fā)成新藥或保健食品、功能性食品提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物體質(zhì)量18～22 g的雄性小鼠384只，180～220 g的雄性大鼠8只，均為上海杰思捷實驗動物有限公司提供(許可證號碼：SCXK滬2013-0006)。本研究符合一般實驗動物倫理學(xué)原則。本研究起止時間為2016年2～8月。

1.2試劑和藥品靈芝菌購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(菌種編號5.0616)；芝芪菌質(zhì)由南京曉莊學(xué)院藥用菌物研究所制備； 江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司收集黃芪藥渣；注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號15102825)；匹多莫德片(賽諾菲，批號140811)；印度墨汁(Solarbio LIFE SCIENCES,No.1221F021)；甲醇、無水乙醇、NaH2PO4、Na2HPO4、Na2CO3(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；0.9～1.1 mm 玻璃熔點毛細管(上海曼賢實驗儀器商行)；刀豆素A(Con A)(美國AMRESCO公司,批號20151217)；D101大孔樹脂(上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號121020)；瑞氏染液、20%綿羊紅細胞懸液、RPMI-1640 培養(yǎng)基和臺盼藍(均購于南京建成生物技術(shù)研究所)；小鼠IgG ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，Lot.M160809-116b)；小鼠IgM ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，Lot.M160914-129a)。

1.3儀器SynergyH1型美國BIOTEK全功能微孔板檢測儀(酶標(biāo)儀)，IX71型奧林巴斯顯微鏡。MCO-5AC型三洋CO2培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1芝芪菌質(zhì)各樣品的制備

2.1.1芝芪菌質(zhì)水提液的制備 取芝芪菌質(zhì)20 g，加10倍量的水加熱回流提取1 h，冷卻，過濾，濾液備用；濾渣再加10倍量的水加熱回流提取1 h，冷卻，過濾。兩次濾液合并，減壓濃縮至50 mL，制成芝芪菌質(zhì)含量為0.4 g·mL-1的芝芪菌質(zhì)水提液。

2.1.2芝芪菌質(zhì)水浸液的制備[6]取芝芪菌質(zhì)20 g，置研缽中研細(研缽置于冰袋中)，再加適量水研磨1 h，水浸液過濾，轉(zhuǎn)移置50 mL容量瓶中，加水定容，制成芝芪菌質(zhì)含量為0.4 g·mL-1的芝芪菌質(zhì)水浸液。

2.1.3芝芪菌質(zhì)各部位的分離制備 將處理好的新購大孔樹脂D101用蒸餾水裝柱，將2.1.1項下的0.4 g·mL-1的芝芪菌質(zhì)水提液加入大孔樹脂分離柱中，分別用4BV量(4倍樹脂體積量)的水、40%乙醇、95%乙醇洗脫，各洗脫部位經(jīng)減壓濃縮回收溶劑后，加水溶解，分別制成芝芪菌質(zhì)含量為0.4 g·mL-1的水洗脫液、40%乙醇洗脫液和95%乙醇洗脫液。

2.2非特異性免疫功能實驗

2.2.1小鼠碳粒廓清實驗[7-9]分組方法：取昆明雄性小鼠96只(18～22 g)，采用隨機數(shù)字表法分成8組：對照組(正常組)、模型(環(huán)磷酰胺)組、陽性(匹多莫德，0.32 g·kg-1)組、樣品組(再分5亞組：芝芪菌質(zhì)水提液、水浸液、水洗液、40%乙醇洗脫液和95%乙醇洗脫液)，每組12 只。除對照組外，其他各組均采用環(huán)磷酰胺復(fù)制免疫缺陷小鼠模型。

造模方法：實驗d1～d3，鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg·kg-1)，1次/天，連續(xù)3 d。d6再以相同劑量再次腹腔注射一次。

給藥方法：d1灌胃給藥，每天0.1 mL/10 g，400 mg·kg-1，1次/天，連續(xù)給藥7 d，d6晚禁食12 h后，d7上午最后1次給藥后立即檢測。

檢測方法： 5倍稀釋的印度墨汁按0.05 mL/10 g體質(zhì)量，每只鼠尾靜脈注射，分別于第2、12 分鐘在小鼠眼眶后靜脈叢用毛細采血管取血20 μL溶于2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1%Na2CO3溶液作空白，測定600 nm處吸光度。

檢測指標(biāo)：取小鼠肝、脾臟，稱量其質(zhì)量。計算廓清指數(shù)K、校正廓清指數(shù)α。

K=(log OD1-log OD2)/(t2-t1)

α=K1/3×體質(zhì)量/(肝重+脾重)

2.2.2雞紅細胞吞噬功能實驗[10-11]分組、造模、給藥方法：同2.2.1。

檢測方法：最后一次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射1%雞紅細胞懸液1 mL。間隔30 min頸椎脫臼處死，仰位固定于鼠板上，腹腔注入生理鹽水1 mL，轉(zhuǎn)動鼠板1 min。然后吸出腹腔液0.5 mL，平均分滴于2片玻片上，用生理鹽水漂洗，自然干燥后以甲醇溶液固定，瑞氏染液染色，干燥后鏡下觀察計數(shù)：

吞噬百分率/%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%；

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%

2.3特異性免疫功能實驗

2.3.1對免疫缺陷小鼠血清溶血素的影響[12-14]分組、造模、給藥方法：同2.2.1。檢測方法：給藥7 d后，每鼠腹腔注射20%綿羊紅細胞(SRBC)懸液0.2 mL致敏，給藥14 d后眼眶取血制備血清。將收集好的血清做系列稀釋，確定最佳稀釋度。吸取稀釋的血清0.5 mL，依次加入20% SRBC、10稀釋補體、0.9%生理鹽水各0.5 mL，空白管用生理鹽水代替血清，混勻，置37 ℃溫箱1 h，再置冰浴中5 min，離心，取上清液于540 nm 處測定OD值，并計算：溶血素含量=樣本血清的OD值×稀釋倍數(shù)。

2.3.2對免疫缺陷小鼠血清IgM、IgG含量影響[15]

分組、造模、給藥方法：同2.2.1。檢測方法：采用ELISA法，按照說明書要求測定血清中IgG、IgM 含量。

2.3.3對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響[16-18]含藥血清的制備：實驗各組大鼠連續(xù)灌胃7 d后，頸動脈取血，制備含藥血清。對照組和ConA組采用的是3只空白大鼠血清(對照組2只，ConA組1只)，其他5組給藥組分別每組1只大鼠制備含藥血清，給藥劑量為400 mg·kg-1。

脾細胞原代培養(yǎng)：小鼠用75%乙醇浸泡5 min，無菌操作取脾臟，用完全RPMI-1640 培養(yǎng)基制備2.0×109·L-1的脾細胞懸液，臺盼藍染料檢測細胞活力>95%以上，備用。

實驗方法：將各組100 μL脾細胞懸液分別加入96孔培養(yǎng)板中，再分別加入Con A(終濃度為5 mg·L-1)及含藥血清，總體積200 μL。設(shè)置只加200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基為空白對照。每實驗組設(shè)10個復(fù)孔。加液后把培養(yǎng)板置于微量振蕩器上振蕩2 min混勻，于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中溫育72 h，變色后用MTT法于酶標(biāo)儀測吸光值A(chǔ)(λ= 490 nm)。增殖指數(shù)SI=樣品組A/ConA組A。

3 結(jié)果

3.1非特異性免疫功能實驗?zāi)Ｐ徒M各檢測指標(biāo)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。表明造模成功，即除對照組外其余各組都是免疫功能低下的小鼠。陽性組各檢測指標(biāo)與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或0.01)，表明匹多莫德片可有效提高免疫功能低下小鼠的機體免疫力。水浸液、水提液和40%乙醇洗脫液組均可顯著提高免疫缺陷小鼠K值、α值、雞紅細胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率(與模型組比較，P<0.05或0.01)，提示它們可顯著提高免疫缺陷小鼠的非特異免疫吞噬功能。但水洗脫液和95%乙醇洗脫液組的各檢測指標(biāo)卻未見顯著增強(與模型組比較，P>0.05)。

3.2特異性免疫功能實驗水浸液、水提液和40%乙醇洗脫液組均可顯著提高免疫缺陷小鼠血清中的溶血素水平和IgM、IgG含量(與模型組比較，P< 0.05,0.01)；此外，水洗脫液組也可顯著提高免疫缺陷小鼠血清中的IgG含量(與模型組比較，P< 0.05)，95%乙醇洗脫液組可顯著提高免疫缺陷小鼠血清中的IgM含量(與模型組比較，P< 0.05)。提示它們均可顯著提高免疫缺陷小鼠的特異性體液免疫功能。見表2。

表1 小鼠碳粒廓清和雞紅細胞吞噬功能實驗結(jié)果

注：與模型組比較，aP< 0.05;bP< 0.01

表2 小鼠血清溶血素和IgM、IgG的含量檢測

注：與模型組比較，aP< 0.05;bP< 0.01

與對照組吸光值相比可見，ConA組可顯著增加小鼠脾淋巴細胞增殖(P<0.05)。水浸液、水提液和40%乙醇洗脫液組的吸光值均顯著增加(與模型組比較，P< 0.05)，提示它們可顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖，從而提高免疫缺陷小鼠的特異性細胞免疫功能。見表3。

表3 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗的結(jié)果

注：與ConA 組比較，aP<0.01

4 討論

本實驗結(jié)果提示：芝芪菌質(zhì)與芝芪菌質(zhì)40%乙醇洗脫部位均具有顯著的促進特異性和非特異性免疫功效；芝芪菌質(zhì)的免疫活性來自其水洗脫液、40%乙醇洗脫液和95%乙醇洗脫液三部位的效應(yīng)綜合，但免疫功效部位主要集中在40%乙醇洗脫液段，而另兩個部位分別僅對一個指標(biāo)有效(IgG，IgM)，提示芝芪菌質(zhì)40%乙醇洗脫部位的免疫促進作用可代表其整體功效；芝芪菌質(zhì)水提液為加熱回流提取，芝芪菌質(zhì)水浸液則在低溫下制備(防止破壞蛋白成分)，但前者的免疫增強功效優(yōu)于后者(多個指標(biāo)P<0.01)，表明加熱提取并不影響芝芪菌質(zhì)的免疫活性。