劉書晶， 吳彩娥， 范龔健， 李婷婷， 應瑞峰

（南京林業(yè)大學 輕工與食品學院，江蘇 南京 210037）

桑葚，俗稱桑果、烏葚和桑泡兒等，是?？粕俣嗄晟颈局参锷涞墓麑?。我國桑葚資源豐富，已被國家衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”的食品原料之一。桑葚不耐儲存，采收后極易變質、失水，目前多被加工成桑葚果汁、桑葚酒和桑葚果醬等。桑葚酒是一種新興的果酒，營養(yǎng)價值高，富含花色苷、黃酮、白藜蘆醇等生物活性物質而被廣泛研究[1]。目前已有關于桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化[2]和香氣成分分析[3]及發(fā)酵期間總花色苷的變化[4]的報道，但是還未見桑葚酒發(fā)酵期間花色苷種類和含量的變化規(guī)律研究。

隨著花色苷的抗氧化[5]、抗腫瘤[6]和預防糖尿病[7]等生理活性被相繼報道，花色苷越來越受到人們的關注?；ㄉ兆鳛樯］刂械闹饕钚猿煞?，對其加工產品的質量表征具有重要意義。目前桑葚酒主要采用葡萄酒釀制中常用的活性釀酒酵母進行發(fā)酵，但不同原料的成分差別較大，采用葡萄酒專用釀酒酵母不能更好地突出桑葚自身的特色[8]。自然發(fā)酵在紅葡萄酒[9]和青梅酒[10]釀造中取得較好的效果。目前還未見桑葚酒自然發(fā)酵的研究報道。

為探明桑葚酒發(fā)酵期間花色苷和抗氧化活性的變化規(guī)律，作者通過測定發(fā)酵期間總酚、總花色苷和花色苷單體質量濃度，游離、聚合和輔色花色苷的質量濃度以及抗氧化活性等指標，并采用主成分分析對其進行綜合評價，有助于促進桑葚酒優(yōu)質化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚：產自山東省濰坊市；1，1-二苯基-2-三硝基 苯 肼 （2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-Azinobis -（3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulphonate），ABTS）、矢車菊-3-葡萄糖苷標準品（純度≥95%），矢車菊-3-蕓香糖苷標準品 （純度≥98.0%）：美國 Sigma公司；三氟乙酸、乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240型紫外分光光度計：日本島津公司；LHS-150HC-11型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：長沙湘儀離心儀器有限公司；Waters2695液相色譜：美國Waters公司。

1.3 桑葚酒自然發(fā)酵

參照葡萄酒釀造工藝[11]制定了桑葚酒自然發(fā)酵的基本工藝。選擇成熟度高、無腐爛的新鮮桑葚，破碎、打漿，放入2.5 L發(fā)酵瓶中，每瓶裝2.0 kg桑葚（約2 L），調整SO2質量濃度至70 mg/L，加蔗糖調整成分至可溶性固形物含量為20°Brix，在18℃恒溫箱中培養(yǎng)。主發(fā)酵期間每天對其進行 “打帽”處理，并取樣測定相關指標；主發(fā)酵結束后，過濾酒液，進入后發(fā)酵，每隔3天測定相關指標。

1.4 測定指標

1.4.1 總酚 參照Fan等[12]的方法略有改動，總酚質量濃度以沒食子酸為標準品，依據(jù)福林-肖卡法測定總酚。精確吸取離心后的桑葚酒200 μL，置于離心管中，加入已經(jīng)稀釋10倍的1.5 mL福林試劑，搖勻，加入1.5 mL質量濃度為75 g/L的Na2CO3溶液，充分混勻，暗處靜置2 h，在紫外-可見分光光度計下，用10 mm比色皿，在725 nm波長下測定吸光值。結果以每毫升桑葚酒中含有相當于沒食子酸的毫克數(shù)表示。

1.4.2 抗氧化活性 采用DPPH和ABTS兩種體系測定桑葚酒自然發(fā)酵期間抗氧化活性的變化，參照楊道強等[13]的方法稍加改動。取200 μL稀釋后的樣品置于10 mL比色管中，加3 mL DPPH溶液，混勻靜置30 min，利用紫外-可見分光光度計，在517 nm測定吸光值。取200 μL稀釋后的樣品，加3 mL ABTS溶液，在暗室反應30 min，利用紫外-可見分光光度計，在734 nm下測定吸光值。

以水溶性維生素E（Trolox）為參照物，結果以每毫升桑葚酒清除自由基能力相當于Trolox清除同等自由基的毫克數(shù)。

1.4.3 總花色苷 取離心后的桑葚酒200 μL，加5mL酸化乙醇，避光靜置30 min，測定其530 nm處吸光度值，結果以矢車菊素-3-葡萄糖苷計[14]。

式中，MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量（449.2）；ε 為摩爾消光系數(shù) （ε=26 900）；DF 為稀釋倍數(shù)。

1.4.4 游離、輔色和聚合花色苷 參考Bimplias等[15]的方法略有改動，通過模擬酒（12%乙醇，5 g/L酒石酸，0.2 mol/L的NaCl，調整 pH值至 3.6）溶液將酒樣稀釋20倍，在520 nm處測定吸光值Awine。將20%乙醛40 μL加到4 mL的酒樣中，靜置45 min，在520 nm處測定待測液的吸光值A。將5%SO2320 μL加到4 mL的酒樣中，在520 nm處測定待測液的吸光值ASO2。

1.4.5 色澤評價 參考Bimplias等[15]的方法并加以改進，未稀釋的桑葚酒樣品用1 mm比色皿分別在420、520、620 nm 處測定吸光值。

1.4.6 花色苷單體 桑葚酒過0.45 μm的濾膜，采用 XBridge-C18 柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），28 ℃進行HPLC分離，紫外檢測器（Waters 2489）。進液量為20 μL，洗脫液為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸（A）和乙腈（B），流速為0.8 mL/min，梯度洗脫。檢測波長為520 nm，洗脫順序見表1。以矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷為標準品，精確稱取花色苷單體標準品并配置成不同質量濃度的花色苷單體標準溶液，在520 nm處檢測吸光度，并繪制標準曲線，計算花色苷單體質量濃度。

表1 桑葚酒花色苷洗脫順序Table 1 Elution order of mulberrywine anthocyanins

1.5 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)重復3次，結果以Mean±SD表示；用SPSS20.0進行顯著性和主成分分析。

2 結果與討論

2.1 桑葚酒發(fā)酵期間總酚質量濃度的變化

如表2所示，桑葚酒發(fā)酵期間總酚質量濃度變化差異顯著（P＜0.05），這與趙紅宇等[5]在桑葚全渣發(fā)酵過程中的結果一致，可能的原因是主發(fā)酵期間采用“打帽”方式，桑葚中的酚類物質不斷溶出，導致桑葚酒總酚質量濃度升高。發(fā)酵第10天后，總酚質量濃度逐漸降低，至發(fā)酵終點變化趨于平緩，總酚質量濃度變化差異不顯著（P＞0.05）。這可能是單寧類等物質聚合、酚類物質氧化作用、微生物產生的酶促使多酚類物質發(fā)生降解，多酚類物質的水溶性下降[16]，使桑葚酒中總酚的質量濃度呈下降趨勢。此外，花色苷作為桑葚酒中主要的酚類物質，其質量濃度變化對桑葚酒總酚質量濃度也有較大的影響。

2.2 桑葚酒發(fā)酵期間抗氧化活性的變化

桑葚酒發(fā)酵期間清除DPPH自由基能力呈先升高后降低的趨勢。桑葚酒在發(fā)酵第3天和第4天時清除DPPH自由基能力最大，比發(fā)酵起點和終點分別高0.79 mg/mL和0.54 mg/mL。桑葚酒發(fā)酵過程中，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，酒液中酚類物質溶出加快，其清除DPPH自由基能力提高。發(fā)酵后期桑葚酒清除DPPH自由基能力下降，這可能是由于桑葚酒中酚類物質受溫度和pH值的影響而發(fā)生聚合和氧化反應[17]。此外，張曉松等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物細胞壁在微生物酶的作用下釋放出蛋白質、多糖等成分，在一定程度上也會影響DPPH的清除能力。桑葚酒發(fā)酵期間清除ABTS自由基能力變化不規(guī)律。ABTS法反映的清除ABTS自由基的能力可與任何羥基化的芳香族化合物反應[18]，這就與DPPH法測定的抗氧化能力存在明顯差異[19]。

表2 桑葚酒自然發(fā)酵期間總酚質量濃度及抗氧化活性變化Table 2 Changes of total phenolic content and antioxidant activity of mulberry wine during spontaneousfermentation

2.3 桑葚酒發(fā)酵期間總花色苷含量的變化

桑葚酒發(fā)酵期間總花色苷含量呈先升高后降低的趨勢，見表3。發(fā)酵第2天達到最高值（530.29 mg/L），這是可能由于發(fā)酵過程中乙醇浸提作用造成的。發(fā)酵結束時，桑葚酒總花色苷質量濃度僅為最高點的32.87%。有研究表明，酵母在酒精發(fā)酵期間能產生β-葡萄糖苷酶能水解花色苷的糖苷鍵，這是導致總花色苷質量濃度下降的主要原因[14]。此外，酒精發(fā)酵過程中產生的丙酮酸和乙醛等小分子物質能與花色苷發(fā)生聚合生成吡喃花色苷[6]，這也有可能導致桑葚酒總花色苷質量濃度下降。

2.4 游離、輔色和聚合花色苷質量濃度的變化

桑葚酒發(fā)酵期間游離花色苷、輔色花色苷和聚合花色苷的比例變化顯著。游離花色苷比例由87.53%下降到70.64%，輔色花色苷比例由9.70%下降到1.73%，聚合花色苷比例由3.63%增加到27.66%。韓富亮等[20]在對紅葡萄酒的研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄中的聚合花色苷雖然很少，但在發(fā)酵期間可促進聚合花色苷的形成，利于葡萄酒顏色的形成。桑葚酒發(fā)酵期間游離、輔色和聚合花色苷質量濃度的變化也體現(xiàn)了這一變化規(guī)律。

2.5 桑葚酒發(fā)酵期間色澤的變化

如表3所示，在整個發(fā)酵期間色度呈下降趨勢，在發(fā)酵第14天達到最低值，為0.47，后發(fā)酵期間，色度趨于穩(wěn)定。這表明桑葚酒發(fā)酵前期，顯色物質的總量在減少，而發(fā)酵后期顯色物質趨于穩(wěn)定，這與發(fā)酵酒液中花色苷等呈色物質的消長規(guī)律有關[21]。一般花色苷質量濃度越高，酒顏色越深，色度越高[22]。色調的變化趨勢與色度相反。色調反映各顏色之間的變化、轉移情況。發(fā)酵過程中，色度的變化會對色調產生影響[21]。桑葚酒發(fā)酵過程中色調不斷增加，說明酒液中顯現(xiàn)黃色物質增加（A420）而顯現(xiàn)紅色物質減少（A520），這與李甜等[23]對紫薯酒發(fā)酵過程顏色變化規(guī)律的研究結果類似。

2.6 桑葚酒發(fā)酵期間花色苷單體比例的變化

經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，桑葚酒中主要存在兩種花色苷單體，見圖1，其出峰時間與標準品矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷一致。陳亮等[24]也證實了桑葚花色苷主要為矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷。桑葚酒發(fā)酵過程中，矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷質量濃度呈下降趨勢，比初始發(fā)酵液（第0天）分別下降了86.84%和72.17%。何英霞等[11]研究認為，酵母在生長繁殖過程中會產生β-葡萄糖苷酶，該酶能將花色苷水解為花青素，而花青素在水溶液中穩(wěn)定性差，易降解。此外，兩種花色苷單體在發(fā)酵過程中降解速率存在較大差異，這是由于矢車菊-3-蕓香糖苷的結構比矢車菊-3-葡萄糖苷復雜，極性小，不易受到水分子的攻擊導致[6]。

圖1 桑葚酒花色苷液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram ofanthocyanins inmulberrywine

2.7 相關性分析

對桑葚酒自然發(fā)酵期間的11項指標進行相關性分析和顯著性檢驗，見表4）?？偦ㄉ召|量濃度與游離花色苷比例、色度、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖糖苷質量濃度呈極顯著正相關關系（P＜0.01），與聚合花色苷比例、色調呈極顯著負相關關系（P＜0.01），聚合花色苷的比例與桑葚酒的色調有極顯著的正相關性（P＜0.01），與色度有顯著的負相關性（P＜0.05），說明花色苷的質量濃度和種類決定了桑葚酒的顏色性質；桑葚酒清除DPPH自由基能力與總酚質量濃度呈顯著正相關（P＜0.05），說明酚類物質是桑葚酒中的主要抗氧化成分。

表3 桑葚酒自然發(fā)酵期間花色苷及色澤變化Table 3 Changes of anthocyanins and color of mulberry wine during spontaneous fermentation

表4 桑葚酒自然發(fā)酵期間各指標相關性分析Table 4 Correlation analysisof each index of mulberry wine during spontaneous fermentation

2.8 主成分分析

主成分分析是利用降維思想，通過描述性統(tǒng)計、差異性檢驗以及發(fā)酵過程的得分圖、載荷圖，把多個指標轉化成少數(shù)幾個相互獨立且包含原來指標大部分信息的綜合指標，通過研究指標體系的內在結構關系，使結果更具有客觀性和準確性[25]。本研究中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別包含了原來信息量的61.77%和22.81%，為了以盡可能少的指標反映盡量多的信息，選取前兩個因子作主成分，代表桑葚酒自然發(fā)酵主要的指標，見圖2。

圖2 不同成分因子載荷散點圖Fig.2 Loadings plot of principal component analysis of different constituents

PC1主要綜合了總花色苷、輔色花色苷、聚合花色苷、游離花色苷、色度、色調、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷的信息，其中聚合花色苷、色調在PC1上呈負向分布，其他呈正向分布，即在PC1坐標正向，PC1越大，聚合花色苷、色調取值則越小。PC2主要綜合了總酚、DPPH、ABTS的信息，其中總酚、DPPH在第二主成分上呈負向分布，ABTS呈正向分布。變量與原點的距離反映其因子載荷，位于坐標軸原點遠端的變量具有較大的因子載荷，位于原點近端的變量具有較小的因子載荷[25]。結合載荷散點圖看，發(fā)酵第0天具有最大的因子載荷，含有較高的生物活性物質，清除DPPH、ABTS自由基的能力也顯著，抗氧化活性高。發(fā)酵第8～10天聚為一類，生物活性物質含量低，抗氧化活性低。發(fā)酵第14-20天含有較高的總酚、清除DPPH、ABTS自由基的能力顯著，見圖3。利用主成分分析基本上反映了發(fā)酵期間桑葚酒花色苷質量濃度、色澤和抗氧化活性的貢獻率，有效地揭示桑葚酒發(fā)酵期間花色苷、色澤和抗氧化活性的內在關系。

圖3 桑葚酒公因子得分圖Fig.3 Common scores scatter plot of mulberry wine

3 結 語

作者研究了桑葚酒自然發(fā)酵期間花色苷、色澤及抗氧化活性變化，并對結果進行了相關性和主成分分析，獲得以下主要結論：桑葚酒發(fā)酵期間花色苷、色澤以及抗氧化活性等指標變化顯著；酚類物質是桑葚酒中主要抗氧化成分，桑葚酒的色澤與花色苷的種類和質量濃度密切相關；對桑葚酒發(fā)酵期間的各指標進行主成分分析，提取得到兩個主成分，其中PC1主要綜合了桑葚酒的色澤以及花色苷組成與質量濃度相關信息，反映了桑葚酒發(fā)酵期間花色苷與色澤之間的變化規(guī)律；PC2主要綜合了總酚質量濃度及抗氧化活性的相關信息，反映了桑葚酒發(fā)酵期間酚類物質抗氧化活性的變化規(guī)律。利用主成分分析有效地揭示桑葚酒發(fā)酵期間花色苷、色澤及抗氧化活性的變化規(guī)律，為更進一步開發(fā)高品質的桑葚酒提供了可行途徑。