黃霞，林家琪，李建基，王亨，崔璐瑩

（揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

孕酮作為一種類固醇激素，對雌性動物的生殖活動起著重要的調(diào)控作用[1]。目前大量研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生與奶牛體內(nèi)的孕酮水平有密切聯(lián)系[2]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜細胞MAPK信號通路的影響目前尚無報道。故本試驗開展了孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞MAPK信號通路的影響研究，通過采用與奶牛產(chǎn)后相似濃度的孕酮處理原代培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞，來檢測MAPK信號通路（ERK、JNK和P38）的磷酸化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛子宮角 奶牛子宮取自揚州屠宰場，無菌采集未孕健康奶牛的子宮，盡快送往實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、孕酮（Sigma，美國）；無內(nèi)毒素胎牛血清（四季青，中國）；蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；兔抗鼠Phospho-p38 MAPK，Phospho-p44/p42 MAPK（ERK1/2），Phospho-SAPK/JNK，β-actin一抗和山羊抗兔二抗（CST，美國）。儀器：PVDF膜（Millipore，德國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；超純水系統(tǒng)（Millipore，美國）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）；蛋白電泳系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國）等。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng)和細胞傳代 無菌采集子宮，帶回實驗室。在超凈工作臺內(nèi)切下子宮角，用預(yù)冷的含有5%雙抗的PBS反復(fù)沖洗3次，至液體澄清，于4℃靜置30min，然后將子宮角縱向剖開，修剪為約3×3 cm2的小塊，放入50 mL無菌離心管中，加入0.1%鏈蛋白酶，至完全浸沒子宮角組織，于4℃消化16～20h。取出子宮角，用滅菌手術(shù)刀輕輕刮取子宮角內(nèi)膜，放置于PBS中重懸，1200r/min離心5min，棄去上清液，再加PBS重懸，離心，重復(fù)3次。然后加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基，吹打成細胞懸液，在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換一次細胞培養(yǎng)液，3～4d即可獲得原代細胞。采用胰蛋白酶消化法進行上皮細胞傳代培養(yǎng)，于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每天換一次細胞培養(yǎng)液，約3 d即可獲得傳代培養(yǎng)細胞[3]。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞活性的影響 將細胞按103cells/孔濃度接種到96孔細胞板內(nèi)，待細胞 80%以上匯合后更換含不同濃度（0、1、3、5、10、20ng/mL）孕酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h；用PBS洗滌，每孔3次；再向每孔加入10μL CCK-8和100μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)混液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在波長490nm處檢測吸光度。每個時間點分組設(shè)置6個重復(fù)，以時間為橫坐標、細胞存活率為縱坐標繪制曲線。

1.2.3 Western blot法檢測MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達量 將細胞按106cells/孔濃度接種到六孔細胞板內(nèi)，待80%以上細胞匯合后用PBS清洗，更換含不同濃度孕酮（0、1、3、5ng/mL）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30min，收集細胞。將細胞經(jīng)胰酶消化處理后，加入適量的細胞裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。每組統(tǒng)一上樣20μg/孔，將分裝好的蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳1.5h。采用半干法將所需蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂乳封閉1h。使用1∶1000稀釋的β-actin一抗孵育PVDF膜，4℃過夜。清洗后，將PVDF膜轉(zhuǎn)移到含有兔抗鼠HRP偶聯(lián)IgG二抗的封閉液中（1∶10000稀釋），室溫孵育1h。使用DAB顯色試劑盒顯影，并用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，根據(jù)得到的圖像數(shù)據(jù)對試驗結(jié)果進行分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA和Duncan法進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以M±S表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞活性的影響 子宮內(nèi)膜上皮細胞經(jīng)不同濃度（0、1、3、5、10、20ng/mL）孕酮處理24h后，用CCK-8法檢測此時子宮內(nèi)膜上皮細胞的活性，結(jié)果如圖1所示。與空白對照組相比，1、3、5、10、20ng/mL 濃度的孕酮未對細胞活性產(chǎn)生影響，且20ng/mL濃度范圍內(nèi)的孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞無毒性作用。

圖1 孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞活性的影響

2.2 不同濃度孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞MAPK信號通路的影響 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞經(jīng)不同濃度（0、1、3、5 ng/mL）孕酮處理 30 min 后，用Western blot法檢測ERK、JNK、P38和p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白的表達水平，結(jié)果如圖2所示。與空白對照組相比，孕酮并未對子宮內(nèi)膜上皮細胞ERK、JNK和P38的磷酸化產(chǎn)生顯著作用，且不同濃度孕酮之間也沒有顯著差異。

圖2 不同濃度孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞 MAPK蛋白表達的影響

3 討論

孕酮是一種重要的生殖激素，對維持妊娠有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在母牛發(fā)情周期中，卵泡期的血漿孕酮一直處于一個較低水平；排卵后，由于顆粒細胞在卵泡刺激素作用下黃體化，孕酮分泌增加[4]。在母牛的發(fā)情周期中，發(fā)情當天孕酮含量最低，為0.37±0.97 ng/mL，一直持續(xù)到發(fā)情后第3 d（均低于1ng/mL），從第4d起孕酮水平升高至1ng/mL以上，到第15d時達到最高值3.9±2.22ng/mL[5]。由于產(chǎn)后孕酮水平會出現(xiàn)急劇下降[6]，所以，我們選擇了與發(fā)情周期相似的孕酮濃度來作用于子宮上皮細胞，以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境。

研究發(fā)現(xiàn)，孕酮的許多功能都是通過與作為配體轉(zhuǎn)錄因子的孕酮受體（PGR）結(jié)合來介導(dǎo)的[1]。最近發(fā)現(xiàn)的PGR激活轉(zhuǎn)錄的機制是通過激活Src/Ras/Raf絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號級聯(lián)能力來實現(xiàn)的。這表明PGR不僅能夠作為轉(zhuǎn)錄因子起作用，而且可以直接激活細胞質(zhì)中的信號傳導(dǎo)途徑[7]。本試驗探究的MAPK信號通路是哺乳動物細胞中關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)生長、發(fā)育、分裂、分化、死亡以及細胞間的功能同步等多種細胞過程[8]。其中，ERK、JNK和P38信號通路經(jīng)炎癥因子刺激活化后，對炎癥起著重要的調(diào)控作用。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)孕酮可通過抑制MAPK活化，下調(diào)對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞TNF-α、iNOS和COX-2的表達，且該下調(diào)作用具有劑量依賴性[9]。這些都提示孕酮有著很好的抗炎效應(yīng)。孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞MAPK信號通路的直接作用尚無報道，故我們選擇與奶牛體內(nèi)環(huán)境相似濃度的孕酮直接作用于經(jīng)體外純化培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞，通過細胞活性試驗和Western blot法來進行檢測。結(jié)果表明，經(jīng)孕酮處理的子宮內(nèi)膜上皮細胞活性并未因濃度的升高而產(chǎn)生較大變化；經(jīng)不同濃度孕酮處理30 min后，MAPK信號通路中的ERK、JNK、P38的磷酸化情況也基本沒有明顯差異。由此我們得出結(jié)論，外源性的孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的MAPK信號通路沒有顯著影響，不能通過孕酮來直接抑制MAPK的活化起抗炎效應(yīng)。這個結(jié)果與Saut JPE得出的“卵巢類固醇對牛子宮內(nèi)膜固有免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng)影響不大”的結(jié)論相一致[10]，具有可靠性。