孫 堯,張 皓,孫佳明,張 輝*,高曉晨*
(1.長春工業(yè)大學(xué),長春 130012;2.吉林省經(jīng)濟管理干部學(xué)院,長春 130012;3.長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117)
半邊蓮是桔??疲–ampanulaceae)半邊蓮屬(Lobelia L.)植物半邊蓮(Lobelia chinensis)的帶根全草,在我國安徽、福建、廣東、廣西、貴州、海南均有生長。我國《中華本草》記載半邊蓮有祛痰、止咳、增強免疫力等功效[1-4]。目前,我國的半邊蓮屬植物的研究較少,主要停留在中草藥配伍方面的研究。生物堿是藥物常見的化學(xué)成分,同時作為被視為現(xiàn)代藥物的最主要來源之一,生物堿是一類常見于植物中的主要含氮有機化合物[5-8]。大部分生物堿類化合物成分具有抗腫瘤、抗感染抗菌等藥理活性[9-10]。本研究主要針對半邊蓮的生物堿類化學(xué)成分,對其化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性進行研究,以期為半邊蓮的化學(xué)成分鑒定及其在抗腫瘤研究中的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 材料與試劑 半邊蓮藥材采由長春中醫(yī)藥大學(xué)提供。1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司產(chǎn)品),胎牛血清(康源生物公司產(chǎn)品),細胞培養(yǎng)板(英國NEB公司產(chǎn)品),牛血清白蛋白及MTT均由實驗室保存。所用試劑均為分析純。
1.2 分離和測試用儀器 Acquity UPLC-Synapt G2 MS色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司產(chǎn)品),LTQ型離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品),高速逆流色譜儀(TBE 20上海同田生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品),Eppendorf centrifuge 5810R 臺式高速大容量離心機(德國Eppendorf公司產(chǎn)品),GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備產(chǎn)品),DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司產(chǎn)品),KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品),BS110S電子天平(德國賽多利斯股份公司產(chǎn)品),T-500型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司產(chǎn)品),酶標(biāo)儀(ELX80 美國BIOTEK公司產(chǎn)品)。
2.1 半邊蓮生物堿類化學(xué)成分的提取 取干燥的半邊蓮全草0.5 kg進行粉碎,用5 L乙醇(95%)乙醇溶液超聲溶解,將乙醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取2次,每次旋蒸提取時間為3 h,提取溶液回收后進行冷凍干燥,冷凍干燥96 h。冷凍干燥成粉末后,取1 mg半邊蓮凍干粉經(jīng)過超聲溶解法溶于10 mL正丁醇中,溶解后將10 mL正丁醇經(jīng)氮吹儀吹干,將吹干后的溶質(zhì),溶于10 mL甲醇中制成制備液,用于后續(xù)檢測。
2.2 半邊蓮生物堿類化學(xué)成分質(zhì)譜分析 Finnigan LTQ質(zhì)譜儀:毛細管溫度250℃;噴霧電壓 4.0 kV,透鏡電壓 -250 V;毛細管電壓 -4 V;質(zhì)量檢測范圍 m/z:200~1 500;注射泵流速 5 μL/min;鞘氣為氮氣流速40 mL/min。
色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm);進樣體積為10 μL;流動相流速為0. mL/min;柱溫為20℃,流動相A:0.1%甲酸水;流動相B:乙腈;流動相C:甲醇。
2.3 單體生物堿的提取 根據(jù)分離生物堿的性質(zhì)及生物堿甲醇溶液極性的大小,采用分析型HSCCC確定選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6:3:2:5,V/V)體系。經(jīng)過超聲脫氣30 min后,在紫外波長254 nm下進行檢測。
采用制備型HSCCC進行分離制備。固定的流速20 mL/min,泵入HSCCC管柱中,管柱中流出50 mL后停泵,運行主機,調(diào)整流動相,使之達到兩相溶劑動態(tài)平衡,50 mL待分離樣品注入HSCCC 儀中,分離生物堿單體組分。紫外檢測波長柱溫25 ℃。根據(jù)色譜圖收集各組分。
2.4 Hela細胞培養(yǎng) 將細胞從- 80 ℃冰箱中迅速取出,置于37 ℃水浴鍋中,待細胞解凍后,漿細胞懸浮液加入15 mL離心管中,再向離心管中加入4 mL細胞培養(yǎng)液,1 000 r/min離心3 min后,棄上清,加入1 mL培養(yǎng)液吹勻,置于培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿體系為9 mL培養(yǎng)液和1 mL血清。
待細胞在培養(yǎng)皿中鋪滿80%以上面積時,將皿中培養(yǎng)基全部棄掉,加入2 mL胰酶,37℃消化2~5 min,待皿中細胞不再貼壁時,加入1 mL血清和3 mL培養(yǎng)基吹起,加入15 mL離心管中離心,將沉淀用3 mL培養(yǎng)液吹起,平均分成3份,分入3個皿中,繼續(xù)培養(yǎng)。
2.5 Hela細胞MTT實驗 10%胎小牛血清加入到96孔板中,每孔加入1 000~10 000個胎牛血清得細胞懸浮液,每孔加入200 μL。待細胞完全貼壁后,每孔加入終濃度為1 mg/mL的各種中藥,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
培養(yǎng)24 h后,每孔加MTT溶液(5 mg/mL用PBS配制,pH = 7.4)20 μL繼續(xù)孵育4 h,吸取上清液并棄掉,每孔加150 μL DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。酶標(biāo)儀以490 nm波長檢測,各孔光吸值,記錄結(jié)果,以時間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。抑制率/% =(對照組OD值-測試組OD值)/對照組OD值×100
3.1 半邊蓮主要生物堿類化學(xué)成分分析 如圖1所示,在正離子模式下共鑒定出5個主要的化合物離子峰。對以上峰1~5峰進行二級譜碎裂MS/MS分析顯示,根據(jù)保留時間及二級普特征碎片及相關(guān)文章參考,鑒定出化合物2,3,4,5為8,10-二乙基山梗酮,新山梗菜堿B,新山梗菜堿A及山梗新堿如表1所示,其主要碎裂方式為失去1分子2-丁酮(72 Da),失去1分子丙酮(58 Da),或失去1分子甲基(14 Da),化合物1為未知化合物,根據(jù)二級普碎裂方式推測可能結(jié)構(gòu)式如圖2所示。
3.2 新山梗菜堿B和新山梗菜堿A逆流色譜提取 本研究采用HSCCC提取含量較高的新山梗菜堿B和新山梗菜堿A2種生物堿,分別得到5 mL新山梗菜堿B和5 mL新山梗菜堿A溶液,以硫酸山梗堿為標(biāo)品,采用紫外分光光度計,繪制硫酸山梗堿含量標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過制硫酸山梗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計算新山梗菜堿B和新山梗菜堿A含量,新山梗堿B含量為3.2 mg/mL,新山梗菜堿A含量為2.4 mg/mL。5 mL新山梗菜堿B和新山梗菜堿A經(jīng)氮吹后。加水配置1 mg/mL的溶液以備Hela細胞MTT檢測用。
圖1 梗菜中主要生物堿類化合物總離子流圖
圖 2 定出山梗菜的主要生物堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式及碎裂方式,紅色虛線表示MS/MS特征碎片化學(xué)鍵斷裂方式
3.3 半邊蓮提取物及其單體生物堿對Hela細胞MTT檢測 為了確定半邊蓮提取物及其單體生物堿樣品是否對Hela細胞的生長具有抑制作用,筆者對梗菜提取物及其單體生物堿樣品對Hela細胞進行MTT檢測。如表2所示,MTT實驗中加入半邊蓮提取物及其單體生物堿樣品后,對Hela細胞生長具有抑制作用。其中培養(yǎng)24 h后,抑制率達到最高。同時可以看出半邊蓮醇提取物對Hela細胞生長的抑制效果不如相同濃度下半邊蓮單體生物堿對Hela細胞生長的抑制率,所以可以確定山梗菜中的生物堿對Hela細胞癌癥模型起抑制作用,且半邊蓮中起決定抗腫瘤效果的是半邊蓮中的生物堿成分,其中新山梗菜堿A對腫瘤細胞的抑制率略高于新山梗菜堿B。
表1 山梗菜中主要生物堿鑒定
表2 1 mg/mL樣品對Hela細胞生長抑制率
本研究采用乙醇回流提取法及正丁醇萃取法,提取出半邊蓮中的主要活性成分,通過UPLC-MS及ESI-MS2的方法,共鑒定出5種半邊蓮中主要生物堿成分,通過二級譜碎裂及保留時間及相關(guān)文獻的查閱確定5種生物堿為8,10-二乙基山梗酮,新山梗菜堿B,新山梗菜堿A,山梗新堿及一種未知生物堿并推測及結(jié)構(gòu)式,通過HSCCC提取主要的2種生物堿新山梗菜堿B和新山梗菜堿A。并通過MTT法檢測半邊蓮總提取物、新山梗菜堿B和新山梗菜堿A2種生物堿分別在24、 48、72 h對Hela細胞的活性檢測??梢钥闯霭脒吷彺继嵛锛捌鋯误w生物堿均對Hela細胞生長具有抑制作用,相同給藥濃度下半邊蓮醇提取物對Hela細胞生長的抑制效果不如半邊蓮單體生物堿對Hela細胞生長的抑制率,可以確定半邊蓮中的生物堿對Hela細胞癌癥模型起抑制作用。