李俊峰，鄭素軍，劉霜，任鋒，陳煜，段鐘平

在糖鞘脂代謝過程中，葡萄糖化神經(jīng)酰胺合成酶（glucosy lceramide synthase，GCS）是催化神經(jīng)酰胺進(jìn)行糖基化的關(guān)鍵酶[1-5]。我們之前的研究均表明鞘脂及其代謝在多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[6-8]。最近我們發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血漿糖化神經(jīng)酰胺的變化與肝內(nèi)壞死性炎癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)[9]。我們推測(cè)內(nèi)源性GCS可能與肝細(xì)胞的增殖和凋亡有一定的聯(lián)系。本研究利用體外siRNA技術(shù)干擾GCS基因表達(dá)，觀察了肝細(xì)胞的增殖和相關(guān)凋亡通路的變化，目的在于探討GCS在肝細(xì)胞增殖過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人源肝細(xì)胞株7702細(xì)胞為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心長(zhǎng)期保存。RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），10%胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的7702細(xì)胞，每孔取1×105細(xì)胞，鋪于24孔板。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去上清，每孔加入siRNA和Lipofectamin 2000混合液。同時(shí)將無(wú)血清無(wú)抗生素的1640培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，同時(shí)將只加轉(zhuǎn)染試劑的Lipofectamin 2000作為轉(zhuǎn)染試劑組。培養(yǎng)6 h，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)UDP-葡萄糖神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase，UGCG）siRNA對(duì)靶基因GCS的干擾效果。UGCG siRNA 序列為：正向（5’→3’）CGC GAA UCC AUG ACA AUA UTT，反向 （5’→3’）AUA UUG UCA UGG AUU CGC GTT；陰性對(duì)照siRNA序列為：正向 （5’→3’）GCGACGAUCUGCCUAAGA UdTdT，反向（5’→3’）AUC UUA GGC AGA UCG UCG UCG CdTdT。人 GCS 引物序列：正向（5’→3’）TTC ATG TGT CAT TGC CTG GC，反向（5’→3’）AGC GTA ATC TGT AGC GAC CA。

1.3 UGCG siRNA對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞 Bcl-2、Bax和 Caspase 3基因水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，取7702細(xì)胞1×105個(gè)/孔，鋪種于24孔板，加入完全培養(yǎng)基1 mL，培養(yǎng)細(xì)胞24 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分為轉(zhuǎn)染組和UGCG siRNA干預(yù)組，培養(yǎng)6 h，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。然后，提取細(xì)胞RNA。采用紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度及純度，在37℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA水平：反應(yīng)體系為20μl，PCR循環(huán)參數(shù)為：步驟 1：50℃ 2 min；步驟 2：95℃ 10 min；步驟3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。人源 GCS、Bcl-2、Bax和Caspase 3基因引物序列為：人Bcl-2正向 （5’→3’）：GTG GCC TTC TTT GAG TTC GG，反向 （5’→3’）：GGC CGT ACA GTT CCA CAA AG；人 Bax正向（5’→3’）：ATG AAG ACA GGG GCC CTT TT，反向（5’→3’）：GCA ATC ATC CTC TGC AGC TC；人 Caspase 3正向（5’→3’）：ACT GGA CTG TGG CAT TGA GA，反向（5’→3’）：GCACAAAGCGACTGGATGAA；人GAPDH 正向（5’→3’）：CCA GAA CAT CAT CCC TGC CT，反向（5’→3’）：CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG。

1.5 肝細(xì)胞Caspase 3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期7702細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3～3.5×105/m1，在wRNA干預(yù)組，37℃培養(yǎng)6 h，換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至24 h，分離蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制12%分離膠10 ml和5%濃縮膠5ml，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%脫脂奶粉按1:800比例配制兔抗人Caspase-3單克隆抗體，將膜浸于抗體中4℃搖床過夜，用5%脫脂奶粉按1:2000比例配制抗兔二抗，浸膜，室溫下?lián)u床上孵育1 h，將ECL發(fā)光試劑A與試劑B以1:1比例混合后，將PVDF膜曝光，掃描分析。應(yīng)用Image J software 1.46軟件分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UGCG siRNA對(duì)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染的抑制作用 將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑按照不同比例轉(zhuǎn)染（兩者以VsiRNA:VLipo=3:1的比例轉(zhuǎn)染，siRNA終濃度為0.12 μmol/L）。將UGCG siRNA和陰性對(duì)照siRNA以VsiRNA:VLipo=3:1的比例轉(zhuǎn)染7702細(xì)胞24 h后，采用PCR法檢測(cè)siRNA對(duì)靶基因GCS基因水平的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UGCG siRNA組相比轉(zhuǎn)染試劑組，GCS基因水平有明顯被抑制的現(xiàn)象（P<0.05），而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組GCS基因水平相對(duì)轉(zhuǎn)染試劑組無(wú)明顯變化（圖1）。

2.2 各組細(xì)胞增殖率比較 與單獨(dú)轉(zhuǎn)染試劑Lipofec tamin 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞比，轉(zhuǎn)染UGCG siRNA后肝細(xì)胞增殖明顯被抑制（P<0.05，圖2）。

2.3 各組細(xì)胞肝細(xì)胞凋亡相關(guān)分子mRNA水平比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比轉(zhuǎn)染試劑組，UGCG siRNA轉(zhuǎn)染組肝細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平顯著下降（P<0.05），Bax mRNA水平顯著升高（P<0.05），Caspase 3 mRNA水平同樣上調(diào)（P<0.05，圖3）。

圖1 各組UGCG siRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后糖化神經(jīng)酰胺酶mRNA水平比較 表明UGCG siRNA能夠降低GCS基因水平

圖2 各組細(xì)胞增殖率比較 表明UGCG siRNA能夠抑制7702肝細(xì)胞增殖

圖3 各組細(xì)胞肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較 表明UGCG siRNA能夠下調(diào)Bcl-2 mRNA水平，上調(diào)Bax和Caspase 3 mRNA水平

2.4 各組細(xì)胞Caspase 3蛋白表達(dá)情況比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染試劑組比，轉(zhuǎn)染UGCG siRNA肝細(xì)胞Caspase 3表達(dá)量上調(diào)（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞Caspase 3蛋白表達(dá)情況 表明UGCG siRNA能夠上調(diào)肝細(xì)胞Caspase 3蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)為首次驗(yàn)證了抑制GCS的基因表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡。本研究在設(shè)計(jì)上采用siRNA技術(shù)靶向干擾GCS的基因表達(dá)，進(jìn)而在GCS表達(dá)特異性抑制的基礎(chǔ)上，探討GCS對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響及其可能的信號(hào)通路。由于凋亡信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，因此本文為初步研究，未能觀察GCS基因表達(dá)的抑制對(duì)其他凋亡信號(hào)通路的影響。但是，基于目前的研究結(jié)果，我們推測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)源性GCS可能參與了肝細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。

在鞘脂代謝中，GCS是催化神經(jīng)酰胺進(jìn)行糖基化的關(guān)鍵酶，通過影響神經(jīng)酰胺和糖鞘脂的代謝平衡來調(diào)控細(xì)胞的生理活性。在神經(jīng)酰胺的糖基化過程中，葡萄糖連接在神經(jīng)酰胺的1-羥基基團(tuán)，從而產(chǎn)生葡萄糖神經(jīng)酰胺[14,15]。GCS是UGCG基因編碼的內(nèi)在膜蛋白，在所有真核細(xì)胞膜上表達(dá)。在GCS表達(dá)下降或者活性減低時(shí)，神經(jīng)酰胺糖基化水平下降，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺水平升高，升高的神經(jīng)酰胺是有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的介質(zhì)，能夠觸發(fā)內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡。而神經(jīng)酰胺激活調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑主要為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體途徑[8]，并參與到TNF α介導(dǎo)的凋亡通路中[16]。本研究首先驗(yàn)證靶向針對(duì)GCS基因的UGCG siRNA序列的干擾效果，發(fā)現(xiàn)該UGCG siRNA序列能夠抑制GCS基因的表達(dá)，繼而在此前提下，進(jìn)一步觀察利用siRNA技術(shù)特異性抑制GCS的基因表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，轉(zhuǎn)染UGCG siRNA的肝細(xì)胞活性明顯下降，說明肝細(xì)胞的增殖可能與GCS被抑制有關(guān)，推測(cè)抑制該酶后可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)酰胺水平升高，進(jìn)而可能參與到肝細(xì)胞活性下降的過程中。

為了更深入研究GCS基因表達(dá)被抑制后引起肝細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步觀察了轉(zhuǎn)染UGCG siRNA后對(duì)肝細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2凋亡途徑的影響。作為抗凋亡基因，Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，而Bax水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。此外，研究證實(shí)Bax在線粒體膜中形成Bax通道，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放并進(jìn)入胞質(zhì)，使Bcl-2與Apaf1分離后，繼而激活Caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18，19]。因此，Bcl-2 和 Bax在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)抑制GCS基因表達(dá)后，可以導(dǎo)致Bcl-2基因水平顯著降低，Bax基因水平升高，推測(cè)糖化神經(jīng)酰胺和神經(jīng)酰胺之間的代謝異?？赡軈⑴c到Bcl-2和Bax調(diào)節(jié)的肝細(xì)胞凋亡過程中。另外，Caspase 3位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，是執(zhí)行凋亡功能的最主要的蛋白酶之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)在抑制GCS基因表達(dá)后，Caspase 3基因水平明顯上升，其蛋白表達(dá)有上升趨勢(shì)，表明可能是由于凋亡相關(guān)基因表達(dá)改變后，最終引起執(zhí)行凋亡效應(yīng)的Caspase 3發(fā)生了變化，其蛋白水平上升不是非常明顯，可能是由于效應(yīng)時(shí)間較短的緣故。

總之，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，利用siRNA干擾技術(shù)體外轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，初步發(fā)現(xiàn)GCS基因表達(dá)下降后，肝細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加，這種效應(yīng)可能與Bcl-2介導(dǎo)的凋亡過程有關(guān)，是各種原因?qū)е翯CS發(fā)生變化后肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制所在。