賓彬,陸海旺,林思偉,王德勝,王杰

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

不育癥是影響人類(lèi)繁衍的重大問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織指出，大約15%的育齡夫婦未能在不避孕12個(gè)月內(nèi)獲得妊娠。流行病調(diào)查顯示，中國(guó)不孕不育發(fā)生率為8.3%(1/12)，盡管其確切的患病率的不十分明晰，而且不同國(guó)家、地區(qū)、種族之間尚有差別，但隨著近年來(lái)環(huán)境的惡化、生活方式和習(xí)慣的改變等各種因素影響，這一現(xiàn)象有逐漸加重的趨勢(shì)，造成了很多家庭的痛苦和困擾。由于大部分男性不育癥無(wú)法找到確切的病因，稱(chēng)為特發(fā)性不育癥，常常表現(xiàn)為少、弱、畸形精子癥，缺乏療效確切的方法，治療的結(jié)局尤其是自然妊娠率也不太令人滿(mǎn)意。雖然輔助生殖技術(shù)發(fā)展迅猛，為很多不育夫婦帶來(lái)了希望，但高昂的費(fèi)用與至今面臨的諸多問(wèn)題和新的問(wèn)題出現(xiàn)，仍困擾著醫(yī)生與患者。

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)在各組織上皮細(xì)胞有廣泛表達(dá)。CFTR基因突變除了導(dǎo)致先天性輸精管缺如外，還可引起精子發(fā)生異常，導(dǎo)致無(wú)精子癥、少精子癥、弱子精癥等精子質(zhì)量異常。李楚艷[1]通過(guò)間接免疫熒光染色法和金霉素染色法研究發(fā)現(xiàn)，隨著CFTR表達(dá)率降低, 精子獲能率也隨之降低, 即CFTR表達(dá)率與人精子獲能和精子頂體反應(yīng)均呈正相關(guān)。

強(qiáng)精煎系筆者治療少、弱、畸形精子癥的經(jīng)驗(yàn)方，多年臨床觀察表明該方可明顯改善少、弱精子癥患者的精子濃度和活力，提高臨床妊娠率[2]。為深入闡明該中藥復(fù)方提高精子濃度和活力的作用機(jī)制，本文誘導(dǎo)建立少、弱精子癥大鼠模型，藥物干預(yù)后，測(cè)定睪丸組織和附睪精子CFTR蛋白表達(dá)情況，以期進(jìn)一步揭開(kāi)其治療少、弱精子癥的部分機(jī)理，為其推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為中醫(yī)藥治療男性不育癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

75只8～9周齡雄性SD大鼠，采購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK桂2014-0002，體質(zhì)量250～280 g。

1.2 藥物

強(qiáng)精煎主要組成藥物有菟絲子、枸杞子、黃芪、鹿角霜、黨參、川續(xù)斷、坤草、當(dāng)歸、生牡蠣等，采用單味中藥免煎顆粒(江陰市天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)1412004)；黃精贊育膠囊由何首烏、酒黃精、枸杞子、菟絲子、肉蓯蓉、淫羊藿、紫河車(chē)、川斷、黨參、當(dāng)歸、丹參、蒲公英、敗醬草、蛇床子、露蜂房、燙水蛭、牡蠣等組成(上海新亞藥業(yè)邗江有限公司，批號(hào)151202)；環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)15122825)。

1.3 主要試劑與設(shè)備

細(xì)胞免疫熒光CFTR蛋白抗體(SANTA，貨號(hào)SC-376683)；倒置熒光顯微鏡(leica，型號(hào)DMi8)；Western blot：SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天公司，貨號(hào)P0015L)；RIPA裂解液(碧云天公司，貨號(hào)P0013B)；Tanon-4200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Millipore公司)。

抗體及其相關(guān)信息：CTFR(160 kd，Santa公司，貨號(hào)sc-37)；Actin(43 kd，三箭公司，貨號(hào)KM9001)；鼠二抗(Jackson公司，貨號(hào)315-035-003)；兔二抗(Jackson公司，貨號(hào)111-035-001)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按隨機(jī)數(shù)字表法平均分成模型組、正常組、黃精贊育膠囊組、強(qiáng)精煎低劑量組、強(qiáng)精煎高劑量組，每組15只。

2.2 動(dòng)物模型的制作及給藥方法

少、弱精子癥模型的建立按照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行，除正常組外，其余4組采用注射用CTX(環(huán)磷酰胺) 40 mg/(kg·d)腹腔注射連續(xù)5天造模法誘導(dǎo)少、弱精子癥大鼠模型。造模成功后，正常組和模型組大鼠每天給予生理鹽水，黃精贊育膠囊組給予黃精贊育膠囊1.11 g /(kg·d)，強(qiáng)精煎低劑量組大鼠每天給予強(qiáng)精煎免煎顆粒6 g/(kg·d)，強(qiáng)精煎高劑量組每天給予12 g/(kg·d)。連續(xù)給藥28天。

2.3 標(biāo)本采集與處理

末次給藥24 h后，以10%水合氯醛腹腔給藥，麻醉各組大鼠，仔細(xì)分離睪丸和附睪。將一側(cè)附睪尾剪碎，間接免疫熒光檢測(cè)步驟：將分離的精子細(xì)胞經(jīng)PBS液洗滌、離心3次去除上清。固定：用4%甲醛固定精子沉淀，4℃過(guò)夜。涂片：將已固定好的精子混懸液標(biāo)本用PBS液離心，洗滌3次后均勻涂在硅烷化的玻璃片上，在室溫狀態(tài)下自然干燥。破膜：采用0.1%TritonX-100/PBS破膜10 min，增加細(xì)胞膜的通透性，以PBS液洗滌3次。封閉：以封閉液在室溫環(huán)境下封閉1 h。 孵育一抗：封閉液稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜。洗片： PBS液潤(rùn)洗細(xì)胞5次。孵育二抗：封閉液稀釋二抗，二抗室溫環(huán)境下孵育1 h。再次洗片(方法同前)。以DAPI染核10 min。第三次洗片(方法同前)。去除多余水分，封片。倒置熒光顯微鏡下觀察并攝像保存。觀察精子數(shù)不少于200個(gè)并計(jì)算 CFTR 在精子上的表達(dá)百分率。

Western blot實(shí)驗(yàn)：取20～50 mg左右的睪丸組織塊，研磨后加入RIPA裂解液(含PMSF)4 ℃裂解1 h，混合均勻，離心后取上清備用。SDS-PAGE電泳：根據(jù)目的蛋白分子量大小配制不同濃度的膠。上樣：待以上膠凝固完成，去梳，洗滌上樣孔，再次上樣；保持恒定電壓80 V，半小時(shí)后改為120 V，持續(xù)1 h電泳。免疫印跡：卸下PAGE膠，裝轉(zhuǎn)膜“三明治”，恒流，300毫安轉(zhuǎn)1 h，完成轉(zhuǎn)膜。免疫發(fā)光：封閉液室溫封閉膜1 h； 孵育一抗：4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜：以TBST洗膜3次(10 min/次)；孵育二抗：室溫孵育膜1 h。洗膜(方法同前)。曝光：把膜放在鋪好的保鮮膜上，均勻滴加A、B混合液于膜上，反應(yīng)60 s。去除底物反應(yīng)液，置平板，曝光，拍照。采用Western blot的灰度分析Quantity One軟件分析實(shí)驗(yàn)圖像結(jié)果，將β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參照，計(jì)算CFTR/β-actin值作為CFTR蛋白的表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 CFTR蛋白在各組睪丸組織中的表達(dá)情況

數(shù)據(jù)顯示，與模型組對(duì)比，CFTR蛋白在黃精贊育膠囊組、強(qiáng)精煎高、低劑量組表達(dá)量均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。黃精贊育膠囊組與強(qiáng)精煎高劑量組蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

3.2 各組附睪精子CFTR表達(dá)對(duì)比

數(shù)據(jù)顯示，與模型組對(duì)比，CFTR在黃精贊育膠囊組、強(qiáng)精煎高、低劑量組表達(dá)率均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。黃精贊育膠囊組與強(qiáng)精煎高劑量組CFTR表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2～6、表2。

圖1 CFTR蛋白在各組睪丸組織中的表達(dá)注：1：正常組 2：模型組3：強(qiáng)精煎高劑量組 4：強(qiáng)精煎低劑量組 5：黃精贊育膠囊組

組別n表達(dá)量正常組151.63±0.05模型組150.31±0.03強(qiáng)精煎高劑量組151.30±0.09▼強(qiáng)精煎低劑量組150.52±0.03▼黃精贊育膠囊組151.28±0.03▼△

注：與強(qiáng)精煎高劑量組相比，△P>0.05；與模型組相比，▼P<0.05

圖2 CFTR在正常組附睪精子中 的表達(dá)(間接免疫熒光染色法，100×)

圖3 CFTR在模型組附睪精子中 的表達(dá)(間接免疫熒光染色法，100×)

圖4 CFTR在強(qiáng)精煎高劑量組附睪精子中 的表達(dá)(間接免疫熒光染色法，100×)

圖5 CFTR在強(qiáng)精煎低劑量組附睪精子中 的表達(dá)(間接免疫熒光染色法，100×)

圖6 CFTR在黃精贊育膠囊組附睪精子中 的表達(dá)(間接免疫熒光染色法，100×)

組別n表達(dá)率正常組150.770±0.075模型組150.199±0.079強(qiáng)精煎高劑量組150.653±0.089▼強(qiáng)精煎低劑量組150.293±0.086▼黃精贊育膠囊組150.609±0.068△▼

注：與強(qiáng)精煎高劑量組相比，△P>0.05；與模型組相比，▼P<0.05

4 討論

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)是一個(gè)具有特殊調(diào)節(jié)功能的Cl-通道。CFTR由跨膜結(jié)構(gòu)域(2個(gè))，核苷酸結(jié)合域(2個(gè))和特殊的調(diào)控域(1個(gè))共5個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。兩個(gè)核苷酸結(jié)合域組成頭-尾相對(duì)的二聚體，兩個(gè)能和ATP結(jié)合的位點(diǎn)(稱(chēng)為位點(diǎn)1和位點(diǎn)2)存在于二聚體之間的接觸面。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)因子大量存在于各個(gè)系統(tǒng)，是cAMP激活的陰離子通道，其突變引起的囊性纖維化病變常常累及呼吸、消化、內(nèi)分泌、皮膚等多個(gè)系統(tǒng)，而CFTR對(duì)人類(lèi)生育繁衍密切關(guān)聯(lián), 該基因的突變常引起先天性雙側(cè)輸精管、附睪、精囊缺如等，精子輸出，成熟和精液的完整性均受此影響，從而引起男性不育癥；而且CFTR 蛋白在精子發(fā)育的過(guò)程中也有著不可替代的作用，任何突變都可能導(dǎo)致精子功能的異常, 從而使受精出現(xiàn)障礙而導(dǎo)致不育[4-7]，其突變頻率的增加或表達(dá)減少與男性先天性輸精管(CBAVD)缺如 、精子形態(tài)異常、無(wú)精子癥、少弱精子癥、精子發(fā)生障礙和性腺雙邊缺失等相關(guān)。CFTR蛋白在精子中有大量表達(dá)，在精子獲能和受精中起關(guān)鍵作用，因?yàn)榫荧@能需要HCO3-，而HCO3-濃度的提高有賴(lài)于Cl-的外流來(lái)實(shí)現(xiàn)，這個(gè)過(guò)程正是由CFTR 蛋白所介導(dǎo)的[8]，假如CFTR蛋白被抑制，則可導(dǎo)致精子獲能障礙[9]。離開(kāi)生精小管的精子，在進(jìn)入附睪組織后進(jìn)一步發(fā)育走向成熟，進(jìn)而達(dá)到獲能的目的，附睪中的主細(xì)胞頂膜介導(dǎo)Cl-及HCO3-這兩種陰離子，大量CFTR定位于頂膜，可見(jiàn)對(duì)附睪液產(chǎn)生離不開(kāi)它的參與，CFTR在精子成熟中的作用也就顯而易見(jiàn)了，此外， CFTR還參與附睪尾主細(xì)胞ATP釋放的調(diào)節(jié)。還有體外實(shí)驗(yàn)顯示，CFTR在生育組精子上的表達(dá)率遠(yuǎn)高于不育組，因此，人類(lèi)精子受精能力降低與CFTR表達(dá)率下降有關(guān)[10]。

腎為先天，主生長(zhǎng)發(fā)育，主藏精，男女生殖機(jī)能與腎精的盛衰密切相關(guān)，腎精是生殖之精的基礎(chǔ)，生殖繁衍離不開(kāi)腎精的充盈，先天不足或后天攝生不當(dāng)，導(dǎo)致腎精匱乏則生殖之精乏源，求嗣多艱[11]；“腎者主水,受五臟六腑之精而藏之”，腎中精氣尤其有賴(lài)于后天脾胃所化的水谷精微充養(yǎng)。脾為后天之本，生血之源，精血可以互化，脾運(yùn)健旺，生殖之精得以化生，若后天飲食不節(jié)，或勞倦傷脾，脾不能為胃行其津液而散精，可致氣血虛弱，先天腎精也難以得到補(bǔ)充?；谝陨侠碚撎接?，筆者導(dǎo)師治療少、弱精子癥強(qiáng)調(diào)以“脾腎兩虛”立論[12-13]，臨證注重“生精強(qiáng)精當(dāng)脾腎氣血并調(diào)”，兼顧濕熱瘀阻，形成“補(bǔ)—通—利”一體的論治體系。本方以杞子補(bǔ)益肝腎之陰,黃芪健旺中州、益脾散精，共為君藥。菟絲子、續(xù)斷補(bǔ)腎生精壯腰膝，黨參、當(dāng)歸，為臣藥，助君藥黃芪益氣養(yǎng)血，以滋生精之源。《本經(jīng)》云五味子“益男子精”，生牡蠣潛陽(yáng)固澀腎精，與五味子兼防陽(yáng)浮精越而妄泄，是為佐。神曲消食，助運(yùn)化，防滋膩礙胃，為使藥。益母草兼活血與利水之能。諸藥成方，有先后(天)并補(bǔ)、氣血同調(diào)、清熱利濕活血作用，有促進(jìn)生精，強(qiáng)精促孕之效。本次實(shí)驗(yàn)中，模型組睪丸組織僅有少量CFTR蛋白表達(dá)，而強(qiáng)精煎和黃精贊育膠囊均不同程度增加了CFTR表達(dá)，表達(dá)量遠(yuǎn)高于模型組(P<0.05)，可能通過(guò)這一途徑增強(qiáng)了精原細(xì)胞的分化，促進(jìn)精子發(fā)生，改善生精障礙；強(qiáng)精煎高、低兩個(gè)劑量組和黃精贊育膠囊組附睪精子CFTR表達(dá)率明顯均高于模型組(P<0.05)，強(qiáng)精煎通過(guò)這一途徑調(diào)控調(diào)節(jié)精子獲能，提高精子受精能力，可能是其治療少、弱精子癥的機(jī)制之一。本次實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未進(jìn)行雌雄大鼠合籠交配試驗(yàn)，以準(zhǔn)確評(píng)估各組樣本精子受精能力水平，后期進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，期望可以得出進(jìn)一步結(jié)論。