白曉慧，楊 華，孟一耕，王 娜，姜巨峰，吳會(huì)民，馮守明

( 天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221 )

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)俗稱黃板鰍，為小型淡水經(jīng)濟(jì)魚類，屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，分布于我國(guó)的黑龍江、遼河中下游、海河、黃河、長(zhǎng)江、錢塘江、臺(tái)灣等水系[1]。天津市位于海河流域下游，是海河五大支流的匯合處和入?？?。20世紀(jì)初，天津濕地面積約 53×104hm2。進(jìn)入21世紀(jì)后，由于濕地水資源匱乏，人工圍墾養(yǎng)殖、旅游開發(fā)及水環(huán)境污染等原因，天津天然濕地面積不斷減少[2-3]，天然經(jīng)濟(jì)魚類資源受到很大的破壞，資源量不斷減少，并出現(xiàn)小型化和低齡化趨勢(shì)，生物多樣性受到嚴(yán)重威脅[4]。天津?qū)氎鎱^(qū)是華北地區(qū)唯一的泥鰍出口地，近年來，由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求的不斷增大，大鱗副泥鰍的養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴(kuò)大。養(yǎng)殖的苗種多為野生捕撈或者野生親本繁殖而來，由于棲息環(huán)境的不斷惡化和捕撈強(qiáng)度的增大，大鱗副泥鰍的野生資源在不斷減少。生物的遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，也是種質(zhì)資源保護(hù)和利用的前提和基礎(chǔ)。線粒體D-loop區(qū)是線粒體上重要的非編碼區(qū)，由于受選擇壓力較小，其進(jìn)化速率是線粒體其他區(qū)域的5～10倍，更適用于種內(nèi)不同群體和相近物種間的遺傳多樣性分析[5]。國(guó)內(nèi)對(duì)天然水域大鱗副泥鰍線粒體遺傳多樣性的研究?jī)H見于黃河流域的山西臨汾、河南新鄉(xiāng)和山東濟(jì)南群體[6]，安徽省的懷遠(yuǎn)、舒城、池州群體[7]及南四湖群體[8]。本研究通過對(duì)天津5個(gè)主要濕地大鱗副泥鰍群體線粒體D-loop序列進(jìn)行多態(tài)性分析，探明其遺傳背景，以期為大鱗副泥鰍種質(zhì)資源保護(hù)和合理開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

5個(gè)大鱗副泥鰍群體分別采自薊州區(qū)于橋水庫(kù)、武清區(qū)大黃堡濕地、寧河區(qū)七里海濕地、靜海區(qū)團(tuán)泊水庫(kù)和寶坻區(qū)潮白新河(圖1)，共72尾。樣本取鰭條放入裝有無水乙醇的離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取、序列擴(kuò)增及測(cè)序

采用醋酸銨沉淀法[9]提取基因組DNA。具體步驟為：每個(gè)樣本剪取鰭條組織約0.2 g放于2 mL離心管中，用剪刀將組織剪碎，加入600 μL的細(xì)胞裂解液(Tris-HCl 100 mmol/L，pH 8.0；EDTA 50 mmol/L，pH 8.0；SDS 1%；NaCl 125 mmol/L)和8 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，放入65 ℃水浴鍋中水浴2～3 h，每隔30 min搖勻一次，直至組織充分裂解。將離心管冷卻至室溫，加入200 μL 7.5 mol/L的醋酸銨，充分搖勻，冰上冷卻5 min或4 ℃冷卻10 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液至新離心管。加入與上清液等體積的異丙醇，輕輕搖勻，室溫下沉淀1～2 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液。加入70%的酒精1 mL洗滌DNA，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，加入無水乙醇1 mL，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄無水乙醇，室溫干燥約20 min，加入50 μL雙蒸水溶解DNA。用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量和質(zhì)量，將各DNA樣品稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 5個(gè)大鱗副泥鰍群體采樣位置

基于GenBank 中大鱗副泥鰍線粒體基因組全序列(NC_023803.1)，用Primer premier 5.0 軟件進(jìn)行擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，引物序列為：MiPd-D1-F，5′-CCAGTAGAACACCCATTT-3′；MiPd-D1-R，5′-ATAAAGTCAGGACCAAGC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。序列擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：5 μL 10×Buffer，5 μL dNTP(10 mmol/L)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，2.5 μL模板DNA，0.5 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，ddH2O 35 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送上海生工生物工程有限公司用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果用BioEdit 7.0.5軟件[10 ]進(jìn)行編輯校正，用Mega 6.0軟件[11]進(jìn)行同源比對(duì)，確定序列長(zhǎng)度，并統(tǒng)計(jì)DNA序列的堿基組成，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹；用DnaSP 5.1軟件[12 ]計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和基因流。用TCS 1.21軟件[13]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖，檢測(cè)單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。用ARLEQUIN 3.5.1.2軟件[14]計(jì)算種群間的遺傳分化指數(shù)并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗(yàn)以及核苷酸不配對(duì)分析，計(jì)算τ值。按下式計(jì)算種群擴(kuò)張時(shí)間：

t=τ/2μk

式中，t為自群體擴(kuò)張開始到現(xiàn)在的時(shí)間，τ為擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)，μ為D-loop基因的突變速率，k為序列長(zhǎng)度。

在本研究中，D-loop基因的進(jìn)化速率采用3%～10%每百萬(wàn)年進(jìn)行計(jì)算[15]。最終的擴(kuò)張時(shí)間T=t×生殖周期。天然水域條件下，大鱗副泥鰍性成熟年齡為2齡，因此生殖周期按2年計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 序列變異及群體遺傳多樣性

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過校正和比對(duì)分析，獲得5個(gè)群體72個(gè)個(gè)體的線粒體D-loop序列，長(zhǎng)度為912～914 bp。Mega 6.0軟件分析結(jié)果顯示，該序列的A、T、G、C堿基平均含量分別31.5%、36.0%、18.6%、13.9%，A+T含量(67.5%)明顯高于G+C含量(32.5%)。所比對(duì)序列中共檢測(cè)出多態(tài)性位點(diǎn)30個(gè)(包括4個(gè)插入/缺失位點(diǎn))，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)5個(gè)，單突變位點(diǎn)21個(gè)，轉(zhuǎn)換/顛換平均值為1.958。

5個(gè)群體72個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到22個(gè)單倍型，單倍型序列GenBank登錄號(hào)為KY441417～KY441438。單倍型在5個(gè)群體中的分布見表1，其中6個(gè)單倍型為群體共有單倍型，16個(gè)單倍型為各群體獨(dú)有的單倍型。5個(gè)群體的多樣性信息見表2，總體的單倍型多樣性為0.813，核苷酸多樣性為0.0015。潮白新河群體的單倍型數(shù)和單倍型多樣性最高，其次為團(tuán)泊水庫(kù)和七里海濕地群體，于橋水庫(kù)群體最低。七里海濕地群體的核苷酸多樣性最高，其次為團(tuán)泊水庫(kù)和潮白新河群體，于橋水庫(kù)群體最低。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)及歷史動(dòng)態(tài)分析

Arlequin軟件計(jì)算得到的5個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)見表3，潮白新河和團(tuán)泊水庫(kù)群體及二者和其他群體間的遺傳分化指數(shù)為-0.0205～0.0427，群體間分化較小(P>0.05)。七里海濕地、大黃堡濕地和于橋水庫(kù)3個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)為0.0496～0.0795，屬中等程度的遺傳分化(P<0.05)。

單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖顯示(圖2)，5個(gè)群體的單倍型個(gè)體呈交錯(cuò)分布，無明顯的地理分支，Hap 1的個(gè)體最多，位于單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖的中央，為5個(gè)群體共享，其他單倍型通過2～10步突變與之連接。采用鄰接法和最大似然法構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹也未表現(xiàn)出明顯的與地理分布相對(duì)應(yīng)的分化譜系，表明5個(gè)大鱗副泥鰍群體未分化成明顯的地理譜系(圖3)。

經(jīng)中性檢驗(yàn)，Tajima′sD檢驗(yàn)及Fu′sFs檢驗(yàn)結(jié)果均為負(fù)值，潮白新河群體和團(tuán)泊水庫(kù)群體的Fu′sFs統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著(P<0.05)，七里海濕地、大黃堡濕地和于橋水庫(kù)3個(gè)群體的Tajima′sD統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著(P<0.05)(表4)。將5個(gè)群體作為1個(gè)整體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，Tajima′s D=-2.241(P=0.001)，F(xiàn)u′s Fs=-25.139(P<0.001)，兩個(gè)值的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均顯著。在核苷酸不配對(duì)分布檢驗(yàn)中，SSD和R指數(shù)兩個(gè)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均不顯著(P>0.05)，說明未顯著偏離群體擴(kuò)張模型。以上這些證據(jù)均表明大鱗副泥鰍可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。根據(jù)5個(gè)群體的整體擴(kuò)張參數(shù)值(τ=3.31)，估算出大鱗副泥鰍種群擴(kuò)張事件發(fā)生在第四紀(jì)更新世晚期(12.1～3.6萬(wàn)年前)。

表1 大鱗副泥鰍5個(gè)群體的變異位點(diǎn)及各單倍型在群體中的分布

表2 大鱗副泥鰍5個(gè)群體D-loop序列的遺傳多樣性參數(shù)

表3 大鱗副泥鰍5個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)(對(duì)角線下)及其相關(guān)P值(對(duì)角線上)

圖2 22個(gè)mtDNA D-loop 單倍型的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化關(guān)系示意

圖3 基于大鱗副泥鰍 22個(gè)單倍型序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹 節(jié)點(diǎn)數(shù)字代表1000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)分析后對(duì)該支的支持百分比(≥50%)，線上為鄰接法，線下為最大似然法.

群體Tajima's DFu's Fs不配對(duì)分布檢驗(yàn)SSDRτ潮白新河 -0.946-3.5678*0.00120.03013.83團(tuán)泊水庫(kù)-1.439-2.68467*0.00650.04553.54七里海濕地-1.608*-1.8380.02220.06803.54大黃堡濕地-1.863*-1.0900.01300.10572.14于橋水庫(kù)-1.685*-1.2870.00010.09412.23總體-2.241*-25.139*0.01170.05283.31

3 討 論

3.1 大鱗副泥鰍群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提，也是評(píng)價(jià)種群資源狀況的重要依據(jù)，一個(gè)物種的遺傳多樣性水平越高，其進(jìn)化的潛力及環(huán)境適應(yīng)能力也越強(qiáng)。按照Grant等[16]的分類，單倍型多樣性以0.5為臨界值，核苷酸多樣性以0.005為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。在本研究的5個(gè)大鱗副泥鰍群體中，除于橋水庫(kù)群體外，其他4個(gè)群體均具有較高的單倍型多樣性(0.7308～0.9080)，但5個(gè)群體的核苷酸多樣性均較低(0.0004～0.0022)。總體來看，5個(gè)群體的單倍型多樣性為 0.8130，核苷酸多樣性為0.0015，屬高單倍型多樣性，低核苷酸多樣性群體，其多樣性水平低于南四湖大鱗副泥鰍群體[8]和安徽4個(gè)野生泥鰍群體[17]以及翹嘴鲌[18](Culteralburnus)、松江鱸(Trachidermusfasciatus)[19]等經(jīng)濟(jì)魚類。高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式在翹嘴鲌[18]、松江鱸[19]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[20]、南四湖湖鱭(Coiliaectenestaihuensis)[21]、鳊(Parabramispekinensis)[22]等多種魚類均見報(bào)道，這種情況可能是由于種群經(jīng)過瓶頸效應(yīng)穩(wěn)定后發(fā)生了擴(kuò)張，種群的快速增長(zhǎng)有利于新突變的保持而使單倍型多態(tài)性增加，但還未能達(dá)到核苷酸序列的多樣化[23]。

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)及歷史動(dòng)態(tài)

遺傳分化指數(shù)是用來評(píng)價(jià)亞群間遺傳分化程度的重要指標(biāo)，遺傳分化指數(shù)<0.05 表明群體間分化較?。贿z傳分化指數(shù)為0.05～0.15，表明群體間存在中等分化；遺傳分化指數(shù)為0.15～0.25，表明群體間高度分化[24]?？傮w來看，本研究中5個(gè)群體的遺傳分化為中等水平。天津地跨海河兩岸，海河是華北最大的河流，支流眾多，本研究中的潮白新河、七里海濕地、團(tuán)泊水庫(kù)和大黃堡濕地4個(gè)群體由海河流域的幾大干流及支流相連通，使得4個(gè)群體間基因交流成為可能，造成群體間遺傳分化程度不高。當(dāng)基因流值>5時(shí)，說明種群間基因交流頻繁，各群體為一個(gè)大的隨機(jī)單元[25]。本研究中，5個(gè)群體的平均基因流值為3.26，且5個(gè)群體均有各自特有的單倍型，說明各群體間尚未有大范圍、頻繁的基因交流。這可能與大鱗副泥鰍的生活習(xí)性有關(guān)，大鱗副泥鰍屬底層魚類，產(chǎn)黏性卵，其生活習(xí)性限制了魚的遷移行為和種群間的基因交流[26]。

單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖未檢測(cè)到與地理分布相對(duì)應(yīng)的分化譜系，單倍型Hap 1為5個(gè)群體共享，位于單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖的中央，推測(cè)可能為祖先單倍型，說明5個(gè)大鱗副泥鰍群體可能起源于同一個(gè)祖先群體。中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對(duì)分布結(jié)果均提示大鱗副泥鰍可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，推算的擴(kuò)張時(shí)間在晚更新世。自晚更新世以來，天津地區(qū)主要發(fā)生了3次大的海進(jìn)海退事件——滄州海侵、獻(xiàn)縣海侵和黃驊海侵，七里海濕地就是全新世晚期以來海退過程在天津平原殘留下來的眾多潟湖之一[27]。由此推斷，天津地區(qū)5個(gè)大鱗副泥鰍群體可能起源于同一個(gè)祖先群體，受晚更新世海進(jìn)海退的影響形成了種群隔離，在棲息地逐漸穩(wěn)定后發(fā)生了擴(kuò)張。

3.3 大鱗副泥鰍的種質(zhì)資源保護(hù)與管理

本研究的大鱗副泥鰍群體為海河水系的主要濕地群體，5個(gè)種群作為1個(gè)整體來看，單倍型多樣性程度較高，但仍低于其他經(jīng)濟(jì)魚類[17-19]，且核苷酸多樣性處于較低水平，其漁業(yè)資源現(xiàn)狀不容樂觀。因此，建議加強(qiáng)對(duì)天津主要濕地水環(huán)境的保護(hù)力度，同時(shí)，建立天津地區(qū)大鱗副泥鰍原種場(chǎng)，加強(qiáng)對(duì)大鱗副泥鰍天然種質(zhì)資源的保護(hù)，并選用遺傳多樣性高的群體開展大鱗副泥鰍人工苗種繁育和良種選育工作，以保證市場(chǎng)的需要，減少對(duì)大鱗副泥鰍野生資源的破壞。