熊禮鳳 楊江升 樓銀妹 汪霖 李平兒 李華美

斑蝥是祖國醫(yī)學(xué)寶庫中，被反復(fù)證明行之有效的抗腫瘤藥物［1］，后人依據(jù)其抗腫瘤的有效成分人工合成了抗癌新藥—去甲斑蝥素（NCTD），在保留斑蝥抗癌活性的同時(shí)，還具有升高白細(xì)胞及增強(qiáng)機(jī)體自身的免疫能力等諸多優(yōu)點(diǎn)，臨床上用于消化道惡性腫瘤的治療方面已取得較好的臨床療效［2-5］。但其在卵巢癌應(yīng)用基礎(chǔ)研究和臨床研究方面還相當(dāng)薄弱［6］。作者自2015年11月至2018年1月通過實(shí)驗(yàn)研究，探討NCTD對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株AO增殖的抑制作用及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株及培養(yǎng)：選擇中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所培育的人卵巢癌細(xì)胞株AO（或3AO）。細(xì)胞在37.0℃，5%CO2條件下，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每間隔72h用0.25%胰蛋白酶消化，傳代1次/2～3d。（2）主要試劑及儀器：去甲斑蝥素（NCTD，北京第四制藥廠）；0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液（Gibco）；RPMI-1640液體培養(yǎng)基及胰蛋白酶（GIBCO）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，博士德）；胎牛血清（四季青）；流式細(xì)胞儀（Beckman-Coulter）。

1.2 方法 （1）人卵巢癌細(xì)胞株AO培養(yǎng)的制備：人卵巢癌細(xì)胞株AO培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般傳代1次/2～3d，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。（2）人卵巢癌細(xì)胞株AO的增殖檢測：取對(duì)數(shù)生長期的人卵巢癌細(xì)胞株AO共約5×105個(gè)分別接種于96孔板，分別加入終濃度為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml， 以 0μg/ml（生理鹽水）為對(duì)照的NCTD分別作用24、48、72h，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以生理鹽水作為對(duì)照。按時(shí)間點(diǎn)收集人卵巢癌細(xì)胞株AO懸液；用100μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸取10μl細(xì)胞懸液加入10μl臺(tái)盼藍(lán)染液中，輕輕混勻，染色1min，吸取少量已染細(xì)胞計(jì)數(shù)。3min計(jì)數(shù)完畢。細(xì)胞抑制率=（對(duì)照組存活細(xì)胞總數(shù)-實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞總數(shù)）/對(duì)照組存活細(xì)胞總數(shù)×100%。（3）流式細(xì)胞儀檢測：取對(duì)數(shù)生長期的人卵巢癌細(xì)胞株AO，按密度約1×106/ml接種于96孔板培養(yǎng)液中，并予終濃度1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml， 以 0μg/ml（ 生 理鹽水）為對(duì)照的NCTD處理48h。48h后予以離心收集全部細(xì)胞，PBS洗2遍，用70%的冰乙醇重懸細(xì)胞，-20℃固定過夜，用PBS洗滌1遍，棄上清液加300μl DNA染液（內(nèi)含碘化丙啶100g/ml和RNA酶20U/ml）37℃避光染色30min，PBS再洗滌2遍，流式細(xì)胞儀上檢測，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的NCTD對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株AO的增殖影響 隨NCTD濃度及作用時(shí)間的遞增，其對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的抑制效率也逐步增加，且各濃度組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度NCTD對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株AO的增殖影響［%，（±s）］

表1 不同濃度NCTD對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株AO的增殖影響［%，（±s）］

注：與0μg/ml比較，#P＜0.05；與1μg/ml比較，*P＜0.05；與5μg/ml比較，△P＜0.05；與10μg/ml比較，☆P＜0.05

濃度（μg/ml）9.01±1.51 18.01±1.65 31.12±2.74 1 20.45±3.25# 37.04±4.65# 54.42±6.41#5 40.82±4.54#* 57.22±6.74#* 75.08±5.49#*10 56.98±4.79#*△ 72.49±4.65#*△ 91.13±3.15#*△20 79.22±5.49#*△☆ 94.11±2.75#*△☆ 98.50±0.35#*△☆作用時(shí)間（h）24 48 72 0

2.2 不同濃度的NCTD對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株AO細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，人卵巢癌細(xì)胞株AO經(jīng)不同濃度的NCTD作用48h后的G0/G1，G2/M與S期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯增加，S期及G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著NCTD濃度的升高，G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯增加，S期及G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度NCTD處理48h細(xì)胞周期分布情況［%，（±s）］

表2 不同濃度NCTD處理48h細(xì)胞周期分布情況［%，（±s）］

注：與0μg/ml比較，#P＜0.05；與1μg/ml比較，*P＜0.05；與5μg/ml比較，△P＜0.05；與10μg/ml比較，☆P＜0.05

57.12±2.40 17.29±1.62 25.51±1.32 1 59.24±1.55# 15.36±0.75# 23.44±2.07#5 62.33±2.61#* 12.16±1.42#* 20.52±0.96#*10 65.20±3.05#*△ 9.61±0.63#*△ 18.46±2.12#*△20 72.14±2.12#*△☆ 7.45±0.36#*△☆ 12.65±1.26#*△☆濃度（μg/ml） G2/M S G0/G1 0

3 討論

卵巢癌是發(fā)生在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的三大腫瘤之一，具有起病隱匿、早期臨床癥狀不典型、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)［7］。因此雖然卵巢癌的發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，位居第3位，但其病死率卻居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位［8］，＞70%的卵巢癌患者就診時(shí)已有盆腔或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，已為中晚期，失去根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，5年生存率均不＞30%［9-10］，嚴(yán)重威脅患者的生命和健康。盡管目前臨床上化療是卵巢癌治療主要手段，但患者對(duì)化療藥物的耐藥性、不敏感性及部分患者對(duì)化療的不耐受性，是腫瘤科醫(yī)師面對(duì)的臨床問題。因此，為卵巢癌患者尋找高效、低毒的抗癌藥物是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

本資料顯示，NCTD抑制人卵巢癌細(xì)胞增殖，在一定濃度下具有劑量及時(shí)間依賴性，NCTD在20μg/ml可短時(shí)間內(nèi)在體外大量殺滅人卵巢癌細(xì)胞株AO。其抗癌機(jī)制是抑制惡性腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，降低腫瘤細(xì)胞CAMP的相關(guān)活性。進(jìn)一步研究NCTD對(duì)人卵巢瘤細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCTD能使人卵巢瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，腫瘤細(xì)胞大多阻滯在G2/M期。提示NCTD誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞株AO生長周期阻滯于DNA合成前期，并導(dǎo)致細(xì)胞分裂期細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞增殖受抑，從而達(dá)到NTCD抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

結(jié)果表明NCTD有望成為一種新型、有效、低毒的抗卵巢癌藥物，也可與各種化療方案聯(lián)用，不僅可增強(qiáng)殺瘤效應(yīng)，還同時(shí)具有升高白細(xì)胞，增強(qiáng)自身免疫力等作用。