耿廣琴, 謝曉蓉

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 甘肅 730000)

甘草(Glycyrrhizauralensis)屬豆科多年生草本植物，是臨床上常用的一種中草藥，性平，味甘，歸十二經(jīng)。甘草主要分布在我國西北干旱、半干旱地區(qū)，具有耐寒、耐旱、耐鹽堿，生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，地面覆蓋度高，地上莖葉養(yǎng)分含量高等特性。因此，甘草也是中國西北干旱、半干旱荒漠化地區(qū)進(jìn)行鹽堿地改良和防風(fēng)固沙的重要的植物資源之一。

由于氣候干燥、蒸發(fā)量大、降水稀少，地下水中的鹽分隨著蒸發(fā)不斷向地表遷移聚集，并且隨著干旱的頻繁發(fā)生、化肥的使用和灌溉，西北地區(qū)土壤鹽堿化日趨嚴(yán)重。目前，中國鹽漬土總面積約為3 460萬hm2，西部鹽漬土面積占全國的69.03%。干旱和土壤鹽漬化已成為制約西北地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題。在西北干旱地區(qū)，甘草生長(zhǎng)期間往往同時(shí)受干旱和鹽脅迫的影響。目前，關(guān)于甘草對(duì)逆境脅迫的生理生化響應(yīng)已有報(bào)道[1-3]，但主要為單一因素的鹽分脅迫或干旱脅迫[4-5]，而旱鹽雙重脅迫下甘草生理生化響應(yīng)研究較少。為此，本研究以一年生甘草為材料，通過研究在旱鹽雙重脅迫下甘草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化功能的變化，進(jìn)而揭示甘草忍耐旱鹽雙重脅迫的生理防御及適應(yīng)機(jī)理，為其在干旱地區(qū)鹽漬土壤中的栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

2015年4月中旬于甘肅省酒泉市金塔縣生地灣采集一年生甘草苗，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定為烏拉爾甘草。

在蘭州市園林科學(xué)研究所溫室內(nèi)開展盆栽試驗(yàn)。選取生長(zhǎng)狀況一致的一年生甘草苗，根長(zhǎng)修剪為20 cm，移栽于高30 cm、內(nèi)徑23 cm的花盆內(nèi)，盆下墊塑料托盤，基質(zhì)為砂質(zhì)壤土，pH 8.1，鹽分含量15.2 g·kg-1，全氮含量18 mg·kg-1，有效磷含量62.82 mg·kg-1。使用前用蒸餾水淋洗除鹽，淋洗后土壤含鹽量低于0.02%，曬干備用。每盆栽植6株，每處理12盆。培養(yǎng)期間每隔7 d澆清水2 L，以保持土壤濕度。待幼苗生長(zhǎng)1個(gè)月后，于5月中旬，進(jìn)行旱鹽雙重脅迫處理。

試驗(yàn)設(shè)置水分脅迫梯度和鹽分脅迫梯度，通過控制澆水時(shí)間、澆水次數(shù)及澆水量，使試驗(yàn)同期達(dá)到相應(yīng)的脅迫處理水平。干旱脅迫處理參照Hsiao[6]旱生植物水分梯度劃分設(shè)計(jì)，使水分同期達(dá)到以下3個(gè)梯度：土壤含水量為田間最大持水量的55%～60% (A1，輕度脅迫)、40%～45%(A2，中度脅迫)、20%～25%(A3，重度脅迫)。鹽分脅迫處理采用NaCl，設(shè)200 mmol·L-1(B，輕度脅迫)、400 mmol·L-1(C，中度脅迫)和600 mmol·L-1(D，重度脅迫)3個(gè)水平，根據(jù)研究報(bào)道甘草可以忍耐含鹽量0.3%～0.6%的鹽化條件，在含鹽量1%～2%的鹽土上生長(zhǎng)不良[7]，本試驗(yàn)將輕度脅迫設(shè)為200 mmol·L-1NaCl。試驗(yàn)開始前按照設(shè)定鹽分脅迫梯度，用去離子水溶解外源NaCl，為避免鹽激，各處理組NaCl總質(zhì)量均分為10次，連續(xù)10 d溶于相應(yīng)當(dāng)天所需加入的清水中，均勻施于花盆中，直到達(dá)到各脅迫的預(yù)定濃度。試驗(yàn)開始后不再施加NaCl，每天下午對(duì)花盆稱重，補(bǔ)充當(dāng)天失去的水分，使各處理土壤保持設(shè)定的含水量。9個(gè)旱鹽雙重脅迫處理為輕度、中度、重度干旱脅迫與200、400和600 mmol·L-1NaCl的隨機(jī)組合(表1)，以土壤含水量為田間最大持水量的75%～80%作為對(duì)照(CK，土壤含鹽量低于0.02%)。在開始脅迫后，每隔25 d測(cè)定一次各項(xiàng)指標(biāo)，共測(cè)定3次，脅迫75 d。

表1 脅迫試驗(yàn)處理Table 1 The design of the experiment to evaluate stress

1.2 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.2.1植株生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 每個(gè)處理隨機(jī)取兩盆采挖12株甘草，用卷尺測(cè)量株高。將甘草用清水洗凈，吸水紙吸干水分，測(cè)量地上部分、地下部分的鮮重。然后105 ℃殺青，置于烘箱55 ℃烘干，測(cè)定地上部分與地下部分的干重。

1.2.2生化指標(biāo)測(cè)定 采集甘草幼苗自上而下第3～5枝復(fù)葉的新鮮葉，每株采取3～4枚鮮葉用于相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。茚三酮顯色法測(cè)定葉片脯氨酸含量[8]；蒽酮比色法測(cè)定葉片可溶性糖含量[9]；考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量；NBT光化還原法測(cè)定SOD活性[10]；硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定MDA含量[11]。

酶解法獲得的甘草葉片原生質(zhì)體，經(jīng)20%蔗糖漂浮后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率，細(xì)胞活力大于95%可繼續(xù)下一步試驗(yàn)。原生質(zhì)體DNA損傷檢測(cè)采用單細(xì)胞凝膠電泳法[12]。選擇尾長(zhǎng)(tail length，TL)、尾矩(tail moment，TM)、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM)為DNA損傷指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Duncan法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱鹽雙重脅迫下甘草生長(zhǎng)指標(biāo)的變化

經(jīng)過處理25、50和75 d，在旱鹽雙重脅迫下，烏拉爾甘草株高，地上鮮、干重和根鮮、干重各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照相比，均有所減少(表2、3、4)。其中75 d時(shí)，重度干旱脅迫下，200、400和600 mmol·L-1NaCl時(shí)，甘草株高分別為對(duì)照的63%、61%、39%，地上鮮重、干重分別均為對(duì)照的69%、70%、45%，根鮮重、干重分別均為對(duì)照的73%、71%、39%。輕度、中度干旱脅迫下，400和600 mmol·L-1NaCl處理，甘草株高，地上鮮、干重和根鮮、干重隨著鹽脅迫濃度的增加而逐步下降，且各處理與對(duì)照間差異顯著(P<0.05)；重度干旱脅迫下，隨著鹽分含量增加，甘草株高，地上鮮、干重和根鮮、干重也下降，但A3B和A3C之間無顯著差異(P>0.05)。同等鹽分脅迫下，隨干旱脅迫增強(qiáng)，烏拉爾甘草株高，地上鮮、干重和根鮮、干重逐步下降。其中在200 mmol·L-1NaCl時(shí)，輕度、中度干旱和鹽分雙重脅迫下，烏拉爾甘草株高，地上鮮、干重和根鮮、干重與對(duì)照組相比，無顯著差異(P>0.05)；在400 mmol·L-1NaCl時(shí)，輕度與中度干旱處理之間無顯著差異(P>0.05)；在600 mmol·L-1NaCl時(shí)，各處理組顯著降低(P<0.05)。

表2 旱鹽雙重脅迫對(duì)烏拉爾甘草株高的影響Table 2 Effect of drought and salt stress on the height of Glycyrrhiza uralensis

同列不同小寫字母表示不同處理間顯著差異(P<0.05)，A1B，A2B,…,A3D同表1，下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different treatments at the 0.05 level. A1B…A3D were same as Table 1; similarly for the following figures.

表3 旱鹽雙重脅迫下烏拉爾甘草地上部分生長(zhǎng)量的變化Table 3 The changes in the shoot biomass of Glycyrrhiza uralensis under drought and salt stress

2.2 旱鹽雙重脅迫下甘草葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

旱鹽雙重脅迫處理下，甘草葉片脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于對(duì)照(表5)。在旱鹽雙重脅迫下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，甘草葉片脯氨酸含量和可溶性糖含量變化趨勢(shì)不同，A2D處理組呈先上升后下降趨勢(shì)，A3D處理組持續(xù)下降，其余各處理組均表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。25 d時(shí)，脯氨酸含量在重度干旱和重度鹽脅迫A3D處理組達(dá)到最大值；在75 d時(shí)，可溶性糖含量在重度干旱和中度鹽脅迫A3C處理組達(dá)到最大值。輕度、中度干旱脅迫中，隨鹽分含量增加，甘草幼苗脯氨酸含量和可溶性糖含量明顯升高，差異顯著(P<0.05)；重度干旱脅迫中，隨著鹽分含量增加，除75 d 時(shí)可溶性糖含量先升后降外，其余各處理組甘草幼苗脯氨酸含量和可溶性糖含量均呈上升趨勢(shì)，各處理組間總體上差異不顯著(P>0.05)。在同等鹽分脅迫下，其中輕度、中度鹽分處理中，隨干旱脅迫增加，甘草幼苗脯氨酸含量和可溶性糖含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但A1B與A2B、A1C與A2C間甘草幼苗脯氨酸含量和可溶性糖含量無顯著差異(P>0.05)；重度鹽分處理中，隨干旱脅迫增加，脯氨酸含量和可溶性糖含量變化沒有明顯的規(guī)律性。

表4 旱鹽雙重脅迫下烏拉爾甘草地下部分生物量變化Table 4 The changes in the root biomass of Glycyrrhiza uralensis under drought and salt stress

表5 旱鹽雙重脅迫下烏拉爾甘草脯氨酸和可溶性糖含量的變化Table 5 The changes in the content of proline and soluble sugar in Glycyrrhiza uralensis under drought and salt stress

2.3 旱鹽雙重脅迫下甘草葉片SOD活性、MDA含量的變化

旱鹽雙重脅迫處理下，甘草葉片SOD活力和MDA含量均高于對(duì)照(表6)。在旱鹽雙重脅迫下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，在A2B、A3B、A1C、A2C處理組，烏拉爾甘草葉片SOD活力呈上升趨勢(shì)，在A3C、A1D、A2D處理組呈先上升后下降趨勢(shì)，在A3D處理組中呈下降趨勢(shì)，MDA含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)則持續(xù)呈上升趨勢(shì)。50 d時(shí)，SOD活力在中度干旱和重度鹽脅迫時(shí)達(dá)到最大值； 75 d時(shí)，MDA含量在重度干旱和重度鹽脅迫時(shí)達(dá)到最大值。在同等干旱脅迫下，輕度和中度干旱脅迫中，隨著鹽分濃度上升，甘草幼苗葉片SOD活力與MDA含量持續(xù)上升，差異顯著(P<0.05)；而重度干旱處理中，甘草幼苗葉片SOD活力變化趨勢(shì)不統(tǒng)一， 25 d時(shí)SOD活力在A3B與A3C之間無顯著差異(P>0.05)；在50、75 d時(shí)在A3C與A3D之間無顯著差異。MDA含量則持續(xù)上升，但在A3B與A3C之間無顯著差異(P>0.05)。輕度、中度鹽分處理中，隨干旱脅迫增加，甘草SOD活力與MDA含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但A1B與A2B、A1C與A2C之間無顯著差異(P>0.05)；重度鹽分處理中，隨干旱脅迫增加，SOD活力變化沒有明顯的規(guī)律性，MDA含量則持續(xù)上升，差異顯著(P<0.05)。

2.4 旱鹽雙重脅迫下甘草原生質(zhì)體DNA損傷的變化

旱鹽雙重脅迫處理下，甘草原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩均高于對(duì)照(表7)。在旱鹽雙重脅迫下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，除A1B處理組DNA尾矩外，其余各處理組烏拉爾甘草原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。75 d、重度干旱、600 mmol·L-1NaCl時(shí)DNA尾長(zhǎng)、Olive尾矩達(dá)到最大值。輕度、中度干旱脅迫下，隨鹽分含量增加，甘草幼苗原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩明顯升高，差異顯著(P<0.05)；重度干旱脅迫下，隨著鹽分含量增加，A3B、A3C、A3D各組甘草幼苗原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩也呈上升趨勢(shì)，但A3B、A3C處理組之間差異不顯著(P>0.05)，顯著低于A3D (P<0.05)。同等鹽分含量處理中，隨干旱脅迫增加，甘草幼苗原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩持續(xù)增加，其中A1B和A2B、A1C和A2C處理組之間甘草幼苗原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩變化無顯著差異(P>0.05),其余各處理組均差異顯著(P<0.05)。

表6 旱鹽雙重脅迫下烏拉爾甘草地下SOD活性和MDA含量的變化Table 6 The changes in SOD activity and MDA content in Glycyrrhiza uralensis under drought and salt stress

表7 旱鹽雙重脅迫下對(duì)烏拉爾甘草原生質(zhì)體DNA損傷的變化Table 7 The changes in protoplast DNA in Glycyrrhiza uralensis under drought and salt stress

3 討論與結(jié)論

植物生存的環(huán)境經(jīng)常受到復(fù)雜多變的逆境脅迫[13-14]。在各種非生物脅迫逆境中，干旱脅迫、鹽脅迫對(duì)植物的影響尤為突出[15-16]。西北干旱半干旱地區(qū)，降水量小，蒸發(fā)量大，溶解在水中的鹽分容易在土壤表層積聚，植物往往受干旱和鹽漬的共同脅迫。因此探討西北地區(qū)植物在干旱和鹽雙重脅迫下的適應(yīng)性具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)，可以通過改變植株形態(tài)，并產(chǎn)生相應(yīng)的生理響應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境脅迫[17-18]。生長(zhǎng)抑制是植物對(duì)環(huán)境脅迫最敏感的生理響應(yīng)[19]。生物量的測(cè)定結(jié)果表明，旱鹽雙重脅迫下，烏拉爾甘草株高，地上鮮、干重，地下鮮、干重均下降，說明旱鹽雙重脅迫對(duì)烏拉爾甘草的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。同等鹽分脅迫下，在200 mmol·L-1NaCl時(shí)，輕度、中度干旱，烏拉爾甘草生長(zhǎng)量與對(duì)照相比無顯著差異，表明甘草具有一定適應(yīng)旱鹽土壤環(huán)境的能力。在鹽分因子小于400 mmol·L-1NaCl時(shí)，輕度與中度干旱處理之間烏拉爾甘草生長(zhǎng)量無顯著差異，說明適度鹽分脅迫在一定程度上增強(qiáng)了甘草抗旱能力。

植物體內(nèi)兩種重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)為脯氨酸和可溶性糖。逆境脅迫時(shí)，植物可通過增加脯氨酸和可溶性糖的含量，提高細(xì)胞液濃度，降低其滲透勢(shì)，來適應(yīng)脅迫環(huán)境[20]。本研究結(jié)果表明，旱鹽雙重脅迫處理下，甘草葉片脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于對(duì)照。在旱鹽雙重脅迫下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，除A2D處理組烏拉爾甘草葉片脯氨酸含量和可溶性糖含量先上升后下降，A3D處理組持續(xù)下降外，其余各處理組均上升，表明在小于400 mmol·L-1NaCl時(shí)，甘草可以通過增加脯氨酸和可溶性糖的積累，來降低細(xì)胞滲透勢(shì)，從而抵御旱鹽逆境。但烏拉爾甘草對(duì)旱鹽雙重脅迫的生理調(diào)節(jié)存在一定的閾值。當(dāng)大于400 mmol·L-1NaCl時(shí)，脯氨酸和可溶性糖的積累便會(huì)降低，甘草的滲透調(diào)節(jié)能力減弱，細(xì)胞處于失水狀態(tài)，甘草的正常生長(zhǎng)受到了影響。雖然，甘草幼苗受到脯氨酸和可溶性糖的共同滲透調(diào)節(jié)作用，但二者最大值出現(xiàn)的時(shí)間、脅迫程度并不同步，說明在旱鹽雙重脅迫中，二者的調(diào)節(jié)作用有差異性。二者在旱鹽脅迫中對(duì)甘草幼苗的滲透調(diào)節(jié)的協(xié)同性以及作用差異性還有待進(jìn)一步開展研究探討。

植物在逆境脅迫下，產(chǎn)生大量的自由基，對(duì)植物細(xì)胞膜造成過氧化損傷[21]，過量的自由基還導(dǎo)致植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷[22]。在逆境脅迫條件下，植物則會(huì)激活抗氧化酶系統(tǒng)，清除或降低自由基的產(chǎn)生，緩解自由基積累對(duì)植物造成的傷害[23]。旱鹽雙重脅迫處理下，甘草葉片SOD活力和MDA含量，原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩均高于對(duì)照。旱鹽雙重脅迫處理下，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，在A2B、A3B、A1C、A2C處理組，烏拉爾甘草葉片SOD活力上升，在A3C、A1D、A2D處理組先上升后下降，而在A3D處理組中下降。但在旱鹽雙重脅迫下，MDA含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，同時(shí)烏拉爾甘草原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩也均增加，表明在小于400 mmol·L-1NaCl時(shí)，輕度、中度干旱脅迫下，烏拉爾甘草能夠通過提高自身SOD活性來清除細(xì)胞內(nèi)多余的自由基，此時(shí)MDA含量雖然增加，但增幅不大，因此對(duì)膜系統(tǒng)的毒害較小。但在大于400 mmol·L-1NaCl或重度干旱脅迫時(shí)，SOD活性增加的速度低于自由基產(chǎn)生的速度，抗氧化酶不足以清除體內(nèi)的自由基，MDA含量增幅加快而大量積累，此時(shí)對(duì)膜系統(tǒng)的破壞程度加重，甘草幼苗的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重影響。說明在旱鹽雙重脅迫下，甘草可以通過提高抗氧化酶活性來抵抗旱鹽脅迫造成的傷害，但同時(shí)也說明抗氧化酶的調(diào)節(jié)能力是有一定限度的。

輕度、中度干旱脅迫下，隨鹽分含量增加，甘草生長(zhǎng)量明顯降低，脯氨酸含量和可溶性糖含量、葉片SOD活力與MDA含量，以及原生質(zhì)體DNA尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩顯著升高，表明輕度、中度干旱脅迫下，相對(duì)于干旱，鹽分是影響甘草生長(zhǎng)量的主導(dǎo)因子。重度干旱脅迫下，隨著鹽分含量增加，上述指標(biāo)變化趨勢(shì)不規(guī)律，可能是在重度干旱脅迫下，甘草生理生化代謝已經(jīng)紊亂。

綜上所述，烏拉爾甘草具有適應(yīng)一定程度的旱鹽脅迫能力，其適宜的脅迫條件為鹽分因子小于400 mmol·L-1NaCl，中度干旱脅迫(田間最大持水量的40%～45%)。在其受到旱鹽雙重脅迫時(shí)，脯氨酸和可溶性糖可降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，來緩解旱鹽雙重脅迫造成的生理代謝不平衡；還可以通過改善或提高抗氧化能力，來緩解氧化與抗氧化失衡以減輕旱鹽脅迫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

環(huán)境脅迫對(duì)植物的影響復(fù)雜多樣，本研究只是探討了旱鹽雙重脅迫對(duì)甘草幼苗階段生理生化特性的影響，不能反映整個(gè)生育期相關(guān)生理生化指標(biāo)變化情況，而在環(huán)境脅迫下植物體內(nèi)的反應(yīng)是復(fù)雜多變的，其相關(guān)規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。