張志飛,武建新,曾寧波,穆 麟,張鶴山,文昭竹

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,湖南 長沙 410128; 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,湖北 武漢 430064)

全球陸地6%的面積是鹽漬土壤,表層土壤中過量的鹽離子通過滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫等對植物造成傷害[1]。不同植物或同一植物的不同品種(或遺傳資源)對鹽脅迫的耐受能力差異較大,選用耐鹽性植物(或品種)是對抗土壤鹽漬化問題的有效途徑。耐鹽性品種選育、篩選時常用發(fā)芽期耐鹽性鑒定對大批量品種(資源)進行初步評價,該方法可操作性強、周期短、效率高[2]。不同植物種子萌發(fā)過程中對NaCl濃度的耐受性差異較大。如孫璐等[3]以6個高粱(Sorghumvulgare)品種進行不同NaCl濃度梯度的發(fā)芽預備試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),150 mmol·L-1NaCl脅迫下,高粱品種間各生長指標的差異最明顯,由此確認150 mmol·L-1NaCl為高粱耐鹽性鑒定的推薦濃度。龍衛(wèi)華等[4]通過分析鹽脅迫下甘藍型油菜(Brassicanapus)的相對發(fā)芽率的變化趨勢,最終確認214 mmol·L-1NaCl為鑒定油菜品系耐鹽性的最適濃度。由此可見,適宜NaCl濃度脅迫的發(fā)芽試驗可用于某一植物大批量材料的耐鹽性評價。

白三葉(Trifoliumrepens)是豆科三葉草屬多年生優(yōu)良牧草,營養(yǎng)價值高,可放牧可刈割;同時還兼具園林綠化、護坡固土、肥土養(yǎng)地和生態(tài)修復等功能[5],但白三葉不耐鹽,這一定程度上限制了其應用范圍。NaCl濃度為0.4%(68.4 mmol·L-1)時,白三葉發(fā)芽勢和發(fā)芽率均較清水對照極顯著降低,幼苗和根的生長受到顯著抑制;NaCl濃度超過0.4%,幼苗中游離脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量隨著鹽濃度的上升而增加[6];白三葉致死NaCl的臨界閾值為300 mmol·L-1[7]。白三葉不同種質(zhì)資源間耐鹽性存在較大差異,如新疆三葉草NaCl溶液半致死濃度(50%發(fā)芽率)是0.6%(102.6 mmol·L-1),瑞文德和海法則依次是0.4%(68.4 mmol·L-1)和0.3%(51.3 mmol·L-1)[8]。盡管白三葉耐鹽性生理生化特性[6-8]、耐鹽機理[9]以及通過轉(zhuǎn)基因[10]、接種益生菌[11]等提高耐鹽性等方面取得了一定研究進展,但目前有關白三葉萌芽期耐鹽性評價指標體系(NaCl脅迫的濃度,評價指標等)和大批量耐鹽性材料評價的研究幾乎未見報道。為此,對來源于俄羅斯的57份白三葉種質(zhì)資源和9份國內(nèi)外育成品種共66份材料進行NaCl鹽脅迫發(fā)芽試驗,通過預試驗篩選適宜的鹽脅迫濃度,然后通過主成分分析篩選耐鹽性評價指標,并采用加權(quán)隸屬函數(shù)法和系統(tǒng)聚類法對66份材料進行耐鹽性排序分類,旨在建立快捷高效的耐鹽性評價體系,篩選耐鹽性強的材料,為白三葉的耐鹽性育種和種植推廣提供科學依據(jù)和理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

66份白三葉種子材料均由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供,其中57份來源俄羅斯,9份是國內(nèi)外育成的品種(表1)。

1.2 試驗方法

各材料選取飽滿、無病蟲害的種子,用50%多菌靈可濕性粉劑500倍液浸泡種子20 min,蒸餾水洗凈待用。為確定白三葉萌發(fā)期耐鹽性評價適宜的NaCl濃度,前期以隨機挑選的6個白三葉材料為對象,分別進行50、100、150、200、250 mmol·L-1NaCl脅迫的發(fā)芽試驗,每重復50粒種子,4次重復,對照(CK)為去離子水。于人工氣候箱進行20℃恒溫培養(yǎng)(16 h/8 h,光照/黑暗),第10天結(jié)束試驗。萌發(fā)和根系指標分析表明,NaCl濃度為50 mmol·L-1時,6份白三葉材料各指標間差異顯著(P<0.05),超過50 mmol·L-1后,各材料不同觀測指標均受到較明顯抑制,指標間差異減小,因此最終確定50 mmol·L-1NaCl溶液用于評價66份白三葉材料萌發(fā)期的耐鹽性。

參照國家牧草種子檢驗規(guī)程 發(fā)芽試驗(GB/T 2930.4-2001),以50 mmol·L-1Na+溶液模擬鹽脅迫條件進行濾紙法發(fā)芽試驗,每重復50粒種子,4次重復,對照(CK)為去離子水。于人工氣候箱進行20 ℃恒溫培養(yǎng)(16 h/8 h,光照/黑暗),第10天結(jié)束試驗。

1.3 觀測指標

每隔24 h觀察記錄發(fā)芽種子數(shù),以胚根或胚芽突破種皮長于種子長度為發(fā)芽標準,第4天計算發(fā)芽勢(%),第10天計算發(fā)芽率(%),并計算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(發(fā)芽指數(shù)×根長)[12]。試驗結(jié)束時,每處理隨機選取10株幼苗,用清水洗凈,用LA-S系列植物根系分析軟件(杭州萬深檢測科技有限公司)進行掃描分析,獲得幼苗的主根長(mm)、苗長(mm)、根苗比(主根長/苗長)、根系表面積(mm2),根系體積(mm3),根系平均直徑(mm)等性狀指標的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運用DPS 7.05和SPSS 22分析軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

指標相對值=指標脅迫處理值/指標對照處理值×100%。

使用相關性分析和因子主成分分析方法對10項觀測指標的相對值進行耐鹽性評價指標篩選；采用模糊數(shù)學中隸屬函數(shù)法[13]和系統(tǒng)聚類法對66份材料耐鹽性進行綜合評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對白三葉種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

白三葉萌發(fā)期對照組的10項觀測指標變異系數(shù)在8.94%～24.98%,說明66份參試白三葉材料的各指標性狀本身存在著差異,且根系體積、根苗比和活力指數(shù)等指標在材料間差異較明顯。鹽脅迫組各指標變異系數(shù)值為12.45%～111.05%,可見66份參試材料在鹽脅迫時各指標性狀表現(xiàn)差異很大,其中活力指數(shù)、根系表面積和根系體積等指標差異最明顯。鹽脅迫組和對照組的10項觀測指標基本統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明:遭受鹽脅迫時,除根系平均直徑增加外,其他項指標均受到抑制(表2)。

表1 66份白三葉種質(zhì)資源信息Table 1 Basic information for the 66 white clover germplasm resources

2.2 10項觀測指標兩兩相關性分析

66份白三葉材料的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率等10項測定指標相對值的兩兩相關性分析結(jié)果表明(表3),除相對發(fā)芽指數(shù)與相對苗長,相對根系平均直徑與相對發(fā)芽率間沒有顯著相關(P>0.05)外,其他各指標間均存在極顯著(P<0.01)或顯著相關關系(P<0.05)。

表2 鹽脅迫下66份白三葉材料10項觀測指標的變化情況Table 2 Variation of 10 index values for the 66 white clover germplasm resources under salt stress

表3 鹽脅迫下66份白三葉材料各指標間相關系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficients of indexes for the 66 white clover germplasm resources under salt stress

* 表示顯著相關(P<0.05), **表示極顯著相關(P<0.01)。RGP,相對發(fā)芽勢;RGR,相對發(fā)芽率;RGI,相對發(fā)芽指數(shù);RVI,相對活力指數(shù);RTL,相對主根長;RSL,相對苗長;RTLSL,相對根苗長比;RRSA,相對根系表面積;RRV,相對根系體積;RRD,相對根系平均直徑。下同。

* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level, respectively. RGP, relative germination potential; RGR, relative germination rate; RGI, relative germination index; RVI, relative vigor index; RTL, relative taproot length; RSL, relative seedling length; RTLSL, relative ratio of taproot length to seedling length; RRSA, relative root surface area; RRV, relative root volume; RRD, relative root diameter; similarly for the following tables.

2.3 耐鹽性評價指標篩選

對66份白三葉材料耐鹽性評價試驗的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率等10項觀測指標進行因子主成分分析(表4),前兩個主成分的累積貢獻率已達到81.9%,且特征值都大于1,表明前兩個成分已經(jīng)把材料81.9%的耐鹽性信息反映了出來。根據(jù)主成分特征值大于1和累積方差貢獻率大于80%的原則,選擇前兩個主成分作為66份白三葉材料耐鹽性綜合評價的主要因子。結(jié)合因子載荷矩陣(表5)可看出:第一主成分特征值為6.5,貢獻率為64.8%,對應特征向量中載荷較大的4個指標是相對活力指數(shù)、相對根長、相對根系表面積和相對根系體積,分別為0.958、0.929、0.939和0.934,這些指標都與植株根系生長相關,因此可定義第一主成分為根系生長因子。根系生長因子中較大特征向量均為正值,說明白三葉的耐鹽性與根系生長指標呈正相關關系,耐鹽性越好的材料植株地下部生長越發(fā)達。第二主成分特征值為1.7,貢獻率為17.0%,對應特征向量中載荷較大的3個指標為相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù),分別為0.702、0.660和0.588,這些指標都與種子萌發(fā)特性相關,因此可定義第二主成分為萌發(fā)特性因子。萌發(fā)特性因子中較大的特征向量均為正值,說明白三葉的耐鹽性與發(fā)芽指標呈正相關關系,耐鹽性越好的材料萌發(fā)特性越好。

表4 兩個主成分的特征值以及貢獻率Table 4 Special values and contributions of two principal components

表5 各因子載荷矩陣Table 5 Loading matrix of each component

綜合指標相關性分析和主成分分析結(jié)果,在第一主成分根系生長因子中選擇與其他根系指標存在極顯著相關且特征向量最大的指標——相對活力指數(shù),在第二主成分萌發(fā)特性因子中選擇與其他指標存在極顯著相關且特征向量最大的指標——相對發(fā)芽率,作為白三葉耐鹽評價的指標對66份白三葉材料進行隸屬函數(shù)耐鹽性綜合評價。

2.4 66份白三葉耐鹽性隸屬函數(shù)綜合評價及聚類分析

相對活力指數(shù)和相對發(fā)芽率均為正向指標,因此用正向隸屬函數(shù)公式計算各材料隸屬函數(shù)值。再根據(jù)變異系數(shù)賦權(quán)公式計算兩項指標的權(quán)重:相對活力指數(shù)的權(quán)重為0.849,相對發(fā)芽勢權(quán)重為0.151。最后,利用綜合隸屬函數(shù)公式計算出66份白三葉材料萌發(fā)期的耐鹽綜合隸屬函數(shù)值(D值)(表6)。將66份白三葉材料的耐鹽綜合隸屬函數(shù)值采用歐氏距離平均連鎖法進行聚類分析(圖1),在歐式距離5處可將參試材料分為3個類群:第1類群包括編號為9、50、51等10份種質(zhì)材料,該類群耐鹽綜合隸屬函數(shù)值均較高(D>0.66),耐鹽性強。值得注意的是第1類群下有兩個亞類群,其中隸屬函數(shù)值排列前三的9、50、51歸為一亞類,耐鹽綜合隸屬函數(shù)值(D>0.90),排名前3;剩余的7份材料為一亞類。第2類群包括編號為31、41、55等10份種質(zhì)材料,耐鹽性居中;第3類群包括編號為35、38、40等46份種質(zhì)材料,綜合隸屬函數(shù)值D<0.30,屬于耐鹽性弱的類群。

分別挑選耐鹽綜合隸屬函數(shù)值排名前3位和后3位以及居中的3個材料進行比較(圖2),可以明顯看出,不同耐鹽級別的代表性材料的根系伸長狀況差異明顯,耐鹽性強的材料植株根系生長受抑制作用小,且有真葉長出;耐鹽性弱的材料在鹽脅迫下生長受到嚴重影響,植株矮小、根短且根尖明顯受損,子葉葉片小。

3 討論與結(jié)論

3.1 種質(zhì)資源耐鹽性評價指標的選擇

種子萌發(fā)期是植物對外部環(huán)境較敏感的時期,萌發(fā)期抗逆性可直接反映植物出苗和后續(xù)生長狀況,因此前人多以植物萌發(fā)期作為評價種質(zhì)資源耐鹽性的重要生育時期[3-8,14-20]。耐鹽性種質(zhì)資源評價時,評價指標存在較大差異。孫璐等[3]通過兩兩相關性分析和主成分分析確定高粱(S.bicolor)耐鹽性篩選指標是根長、葉重和發(fā)芽率,并將42個高粱品種分為高度耐鹽、耐鹽、中等耐鹽、鹽敏感以及高度鹽敏感5個類型。于潔等[15]采用灰色關聯(lián)分析對10 份苜蓿屬(Medicago)植物萌發(fā)期的耐鹽性指標進行篩選,最后確定發(fā)芽率和幼苗干重,作為鑒定供試材料耐鹽性指標。孟祥浩等[16]選用發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚芽鞘長、根長、苗高、第 1 片葉的生長速度以及苗鮮質(zhì)量等指標作為冬小麥(Triticumaestivum)萌發(fā)期耐鹽性篩選指標,從11個冬小麥品種中篩選出兩個耐鹽能力強的品種。宮文龍等[17]通過測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長及根長從22個苜蓿品種中篩選出三得利、新牧1號和生存者等3個耐鹽性最強的品種。陳新等[18]以發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、苗高4個鑒定指標的耐鹽系數(shù)進行加權(quán)隸屬函數(shù)綜合評價278份裸燕麥(Avenasativa)種質(zhì)的耐鹽性。

表6 66份白三葉種質(zhì)資源耐鹽隸屬函數(shù)排序Table 6 Ranking of salt tolerant subordinate function values for the 66 white clover germplasm resources

圖1 66份白三葉材料耐鹽性聚類Fig. 1 Dendrogram of salt tolerance for the 66 white clover germplasm resources

圖2 不同耐鹽水平代表材料的植株形態(tài)對比Fig. 2 Comparison of representative material appearance with different salt tolerance

本研究通過指標相關性分析和因子主成分分析從萌發(fā)指標、根系指標等10項指標中篩選出相對活力指數(shù)和相對發(fā)芽率兩項指標作為白三葉萌發(fā)期耐鹽性評價指標,并根據(jù)變異系數(shù)賦權(quán)計算各指標權(quán)重。篩選出的指標與前人的評價指標具有較高一致性:發(fā)芽率、發(fā)芽勢和根長普遍被接受為萌發(fā)期耐鹽性評價的重要指標[15-19],本研究活力指數(shù)基于萌發(fā)指數(shù)×根長,主成分分析時,相對活力指數(shù)、相對根長、相對根系表面積和相對根系體積都屬于第一主成分,對應特征向量中載荷較大,根據(jù)兩兩相關性,選擇了相對活力指數(shù)。發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長的測定方法簡單,而且通過相關性分析和因子主成分分析將復雜的多指標去重復、簡單化,通過指標的權(quán)重既能全面反映白三葉的耐鹽性信息,又能客觀區(qū)分指標的重要性,是一套用于評價白三葉種質(zhì)資源耐鹽性的較為科學、系統(tǒng)、快捷的方法,可應用于白三葉苗期耐鹽性種質(zhì)資源鑒定和篩選。

3.2 白三葉的耐鹽性

一定濃度范圍的Na+通過滲透效應和離子效應抑制植物種子萌發(fā)[20-21],NaCl脅迫造成白三葉細胞膜系統(tǒng)的損傷,且脅迫強度越大細胞膜受損越大;同時過量的Na+還會影響白三葉葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量、超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性等指標,最終造成白三葉的存活率和相對株高呈顯著下降趨勢[2,22]。本研究亦發(fā)現(xiàn)白三葉在受鹽脅迫后種子萌發(fā)性能和根系生長均受到不同程度的抑制,參試的66份白三葉材料耐鹽性分為強、中、弱3個級別,耐鹽性強的材料受鹽脅迫的傷害輕,反之則重,其中耐鹽性較好的白三葉種質(zhì)材料有10份:CF022540、CF022469、CF022538、CF022541、惠亞、ZXY06P-2659、CF022543、CF022470、CF022508及CF022466。除惠亞是新西蘭育成品種外,其余9份材料都是來自俄羅斯的野生種質(zhì)資源,這說明野生資源中有大量的耐鹽資源,未來應加大對野生白三葉種質(zhì)資源的搜集和挖掘,為耐鹽白三葉選育和耐鹽品種推廣提供材料。