劉大麗 ，馬龍彪

（1.黑龍江省高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

甜菜是我國主要的產(chǎn)糖作物，我國的甜菜大部分種植在沒有灌溉條件的旱地上，依靠自然降水維持甜菜生長。近幾年來，由于甜菜生長長期受春季干旱、夏秋高溫等嚴(yán)重天氣的影響，其產(chǎn)量及含糖都會受到一定的損失[1-2]。干旱嚴(yán)重地制約了甜菜的生產(chǎn)水平和發(fā)展，為此，如何改良甜菜的抗旱特性已成為目前倍受國內(nèi)外專家關(guān)注的研究內(nèi)容[3-5]。傳統(tǒng)的常規(guī)抗旱育種由于受到時間以及種質(zhì)資源等因素的限制，很難篩選出具有較優(yōu)良抗旱特性的甜菜品種[6]。然而，隨著抗旱分子機(jī)制研究的不斷深入，人們通過挖掘一系列與抗旱脅迫相關(guān)的功能基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將與抗旱脅迫相關(guān)的關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)[7]，為培育高效抗旱、抗高溫的甜菜新品種開創(chuàng)了一條嶄新的途徑。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）通過谷胱甘肽-抗壞血酸還原系統(tǒng)清除ROS，是植物體內(nèi)抗氧化耐旱機(jī)制之一，并被廣泛應(yīng)用到植物的抗干旱分子育種中。GSH的生物合成經(jīng)歷兩個ATP參與的反應(yīng)步驟：在γ-GCS（EC6.3.2.2）和GS（EC6.3.2.3）酶編碼基因先后調(diào)控著植物體內(nèi)GSH的合成，進(jìn)而調(diào)控著植物體內(nèi)GSH抗氧化耐旱性[8]。而在革蘭氏陽性菌中，存在著一類新型的具有雙重功能的谷胱甘肽合成酶StGCS-GS（γglutamylcysteine ligase-glutathione synthetase）。研究表明，該酶既不受氧化還原調(diào)控，又對GSH的反饋抑制不敏感，這與以往被報道的谷胱甘肽合成酶作為限速酶受到產(chǎn)物GSH的抑制有了質(zhì)的不同[9]。

本研究正是綜合了以上研究進(jìn)展以及甜菜分子育種的發(fā)展趨勢，將嗜熱鏈球菌谷胱甘肽合成酶（StGCSGS）——這種新型非限速酶，通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到具有潮霉素抗性的植物表達(dá)載體pGWB2上，進(jìn)而遺傳轉(zhuǎn)化到甜菜植株中；通過基因組DNA的PCR鑒定，獲得陽性轉(zhuǎn)基因甜菜植株，為下一步甜菜耐干旱脅迫研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)條件

供試甜菜US-8916，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所提供。甜菜種子通過0.1%的升汞殺菌8 min，無菌水沖洗后，接種于MS培養(yǎng)基中，2周后獲得無菌苗。利用甜菜分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA）對所得到的無菌苗進(jìn)行分化再生；利用生根培養(yǎng)基（MS+1.5 mg/L NAA）對甜菜幼芽進(jìn)行生長和生根培養(yǎng)。

1.2 p ENTR/SD/D-TOPO-StGCS-GS入門載體的構(gòu)建

根據(jù)嗜熱鏈球菌谷胱甘肽合成酶 （StGCS-GS）（Genbank accession no.GQ848551）的堿基序列，以及Gateway植物表達(dá)載體系統(tǒng)中其入門載體pENTR/SD/D-TOPO（Invitrogen）的要求，利用Primer primier 5.0設(shè)計起始密碼子前端帶有CACC接頭的上下游引物 （5’-CACC ATG ACA TTA AAC CAA CTG CTT-3’；5’-TTA AGT TTG ACC AGC CAC TAT TTC T-3’）。

以實驗室保存的pMD 18-T-StGCS-GS[9]為模板，利用Trans Start FastPfu DNA Polymerase（Trans Gen）高保真 Taq 酶擴(kuò)增目的基因。 反應(yīng)條件為：95℃（2 min）；95°C（20 s），52℃（20 s），72℃（2 min），30 個循環(huán)；72℃培育5 min。

按照摩爾比1∶1，將膠回收目的片段連接到載體pENTR/SD/D-TOPO上。通過PCR及BamHI酶切鑒定陽性入門重組質(zhì)粒，產(chǎn)物于1%Agarose凝膠電泳，并利用GeneSnap 6.08（f）來進(jìn)行檢測。

1.3 pGWB2-StGCS-GS植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶XhoI對植物表達(dá)載體pGWB2進(jìn)行線性酶切；將100 ng Entry clone（pENTR/SD/DTOPO-StGCS-GS）和 150 ng Destination clone（pGWB2）進(jìn)行 LR反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans DH5α（Trans Gen）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過PCR及HindIII酶切鑒定的Kana抗性克隆pGWB2-StGCS-GS被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，備用。

1.4 甜菜遺傳轉(zhuǎn)化

以甜菜無菌苗的葉柄為轉(zhuǎn)基因的外植體，接種于MS+0.5 mg/L 6-BA中2 d；分別用濃度為OD600=0.4、0.6、0.8的pGWB2-StGCS-GS農(nóng)桿菌EHA105侵染甜菜葉柄外植體，侵染時間為5 min、10 min、15 min；將侵染后的甜菜外植體葉柄置于含有100μmol/L AS和0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2 d、4 d、6 d；然后轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+50 mg/L Hygromycin）中進(jìn)行抗性芽的分化和篩選。

1.5 甜菜基因組DNA的提取及轉(zhuǎn)基因甜菜的分子鑒定

利用CTAB法提取甜菜基因組DNA。以未轉(zhuǎn)基因甜菜為對照，PCR擴(kuò)增StGCS-GS基因，同1.2。取20 μL PCR產(chǎn)物，于1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并利用GeneSnap 6.08（f）進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 入門載體pENTR/SD/D-TOPO-StGCS-GS的構(gòu)建

根據(jù)Gateway克隆系統(tǒng)中TOPO entry clone對于目的基因的要求，以及Streptococcus thermophilus StGCS-GS基因的序列信息，設(shè)計上游引物前端帶有CACC的堿基序列。通過高保真Taq酶擴(kuò)增帶有平末端的基因片段，獲得了2.26 kb的目的片段（圖1）。

將定量為50 ng/μL的StGCS-GS PCR擴(kuò)增片段，與TOPO入門載體pENTR/SD/D-TOPO按照1∶1的摩爾比例進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。如圖2A所示，通過提取重組大腸桿菌質(zhì)粒DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在pENTR/SD/D-TOPO-StGCS-GS待測質(zhì)粒中得到了預(yù)期大小——2.26 kb的片段。BamHI限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果顯示，在4.86 kb左右的位置獲得了單一條帶（圖2B）。由于pENTR/SD/D-TOPO載體本身大小為2.5 kb左右，而BamHI在StGCS-GS基因內(nèi)部有單一酶切位點，在TOPO載體上沒有酶切位點，所以酶切后會獲得單一目的條帶。因而，酶切結(jié)果進(jìn)一步證明了重組質(zhì)粒pENTR/SD/D-TOPOStGCS-GS的正確性。

圖1 帶CACC接頭的嗜熱鏈球菌StGCS-GS的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Streptococcus thermophilus StGCS-GS with CACC tag

圖2 p ENTR/SD/D-TOPO-StGCS-GS重組質(zhì)粒鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmids of pENTR/SD/D-TOPO-StGCS-GS

圖3 pGWB2-StGCS-GS重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmids of pGWB2-StGCS-GS

2.2 pGWB2-StGCS-GS植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將100 ng pENTR/SD/D-TOPO-StGCS-GS入門載體與150 ng pGWB2線性化植物表達(dá)載體分別進(jìn)行LR反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增陽性重組質(zhì)粒在預(yù)期大小的位置獲得了目的條帶——2.26 kb。利用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切pGWB2-StGCS-GS，在19.3 kb左右的位置獲得了單一條帶。由于在pGWB2體內(nèi)，HindIII是單一的酶切位點，并且在StGCS-GS基因內(nèi)部沒有HindIII酶切位點，因而所獲得的片段長度應(yīng)該是載體（17 kb）和目的基因片段的總長。所得結(jié)果與預(yù)期一致，表明實驗正確構(gòu)建了植物表達(dá)載體pGWB2-StGCSGS（圖 3）。

利用電擊法，將重組的植物表達(dá)載體pGWB2-StGCS-GS分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。

2.3 StGCS-GS基因?qū)μ鸩说倪z傳轉(zhuǎn)化

甜菜種子經(jīng)過升汞消毒處理后，培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基中，一周后，種子萌發(fā)出幼芽（圖4A）；經(jīng)過分化、生根獲得的甜菜組培苗葉柄段，被用于甜菜轉(zhuǎn)基因研究（圖4B～D）。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜葉柄轉(zhuǎn)化操作，將StGCS-GS遺傳轉(zhuǎn)化到甜菜體內(nèi)。研究結(jié)果表明，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值為0.6，侵染時間10 min，共培養(yǎng)4 d后，甜菜葉柄外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染，在篩選培養(yǎng)基上所獲得的抗性芽（圖4E）比率相對最高；而侵染濃度和時間過高或過長，都會由于農(nóng)桿菌生長頻率較快而導(dǎo)致甜菜葉柄死亡。所獲得的具有Hygromycin抗性的抗性芽，通過誘導(dǎo)分化和生根，獲得了抗性植株（圖4F）。

圖4 甜菜再生體系建立及StGCS-GS基因轉(zhuǎn)化過程Fig.4 Regeneration of Beta vulgaris and genetic transformation of StGCS-GS

2.4 轉(zhuǎn)基因StGCS-GS甜菜植株的分子鑒定

CTAB法提取8個具有Hygromycin抗性的轉(zhuǎn)基因甜菜基因組DNA，如圖5所示，在對照甜菜植株體內(nèi)，未檢測到StGCS-GS基因的表達(dá)；而在轉(zhuǎn)基因甜菜株系中，分別不同程度地檢測到StGCS-GS基因的大量表達(dá)；其中，St3、St5和St7轉(zhuǎn)基因株系的StGCS-GS基因表達(dá)量相對較大；St8呈假陽性。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因甜菜植株體內(nèi)，35S啟動子可以大量地正確表達(dá)StGCSGS基因，并且由于該基因在甜菜基因組內(nèi)的整合位點不同，所以表達(dá)量也有所不同。

圖5 StGCS-GS轉(zhuǎn)基因甜菜植株基因組的PCR鑒定Fig.5 Detection of StGCS-GS in transgenic Beta vulgaris genome by PCR

3 討論

甜菜轉(zhuǎn)基因方面的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但大多數(shù)研究主要集中在抵御病害或提高甜菜含糖率等方面[10]；而對于如何利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高甜菜抗旱特性的研究鮮有報道。本研究應(yīng)用Gateway基因克隆系統(tǒng)，把目的基因StGCS-GS克隆到入門載體（Entry vector）——pENTR/SD/D-TOPO上，該載體的最大特點是不用依賴于限制性內(nèi)切酶，而靠載體自身存在的特定重組位點和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到植物表達(dá)載體（Destination vector）——pGWB2上。同時，由于甜菜本身對Kana中度敏感，所以選擇具有潮霉素抗性的植物表達(dá)載體可避免由于假陽性所帶來的麻煩。

嗜熱鏈球菌非限速谷胱甘肽合成酶StGCS-GS的獨特之處在于它可以不受任何因素 （包括底物在內(nèi)）的影響而高效地催化植物體內(nèi)GSH的合成，以清除由于干旱逆境脅迫所導(dǎo)致的有害活性氧物質(zhì)的毒害。本研究通過分子生物學(xué)手段鑒定獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因株系。由于目的基因在甜菜基因組內(nèi)的整合位置和拷貝數(shù)等的不同，其表達(dá)量也存在一定差異。試驗結(jié)果也為下一步甜菜抗旱逆境脅迫的研究，獲得具有優(yōu)良抗旱特性的甜菜品種奠定了基礎(chǔ)。