張明玥 潘葦芩 葛婧 陳冬云 王偉萍

【摘 要】 目的：建立蘇合香丸中11-羰基-β-乙酰乳香酸的定性定量檢測(cè)方法。方法：采用薄層色譜法和高效液相色譜法，建立蘇合香丸中乳香類(lèi)成分11-羰基-β-乙酰乳香酸的檢測(cè)方法。結(jié)果：運(yùn)用建立的薄層色譜法檢測(cè)了3個(gè)生產(chǎn)廠家提供的9批蘇合香丸，均含有11-羰基-β-乙酰乳香酸，但含量不同，故建立高效液相色譜法對(duì)3個(gè)廠家22批蘇合香丸進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)論：建立的薄層色譜法和高效液相色譜法可用于蘇合香丸中11-羰基-β-乙酰乳香酸的定性定量檢驗(yàn)，為蘇合香丸質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 蘇和香丸；11-羰基-β-乙酰乳香酸；薄層色譜法；高效液相色譜法

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）02-0029-04

Abstract：Objective To establish the qualitative and quantitative analysis methods for 11 - hydroxy acid - beta - acetyl mastic in Suhexiang pills. Methods The TLC and HPLC were used for identification and content determination of 11 - hydroxy acid - beta - acetyl mastic in Suhexiang pills. Results 9 batches of Suhexiang pills from 3 manufacturers were tested by The TLC，The result showed that the pills all contained 11 - hydroxy acid - beta - acetyl mastic， however，the content was with significant difference，so the quantitative analysis method of HPLC was established to and 22 batches of Suhexiang pills from 3 manufacturers were analyzed with the methed. Conclusion The established method of TLC and HPLC can used to qualitatively and quantitatively analyze 11 - hydroxy acid - beta - acetyl mastic in Suhexiang pills.which provides a scientific basis for quality control and evaluation of Suhexiang pill.

Keywords：Suhexiang pills；11-hydroxy acid-beta-acetyl mastic；TLC；HPLC

蘇合香丸是芳香開(kāi)竅的代表方之一，由蘇合香、安息香、乳香（制）等15味藥材組成，適用于痰厥昏迷、中風(fēng)偏癱、肢體不利等癥[1-2]。處方中的臣藥乳香在市場(chǎng)上價(jià)格較高，代用品、混淆品較多。2015年版《中國(guó)藥典》一部[3]乳香項(xiàng)下采用揮發(fā)油測(cè)定法控制其含量；蘇合香丸項(xiàng)下僅對(duì)冰片和丁香的含量進(jìn)行了測(cè)定，均未建立乳香有效成分的含量測(cè)定。文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]乳香中總?cè)祁?lèi)有機(jī)酸是其抗炎、鎮(zhèn)痛、抗免疫的主要有效成分，而11-羥基-β-乙酰乳香酸為三萜酸類(lèi)化合物的主要活性成分之一。為進(jìn)一步有關(guān)控制蘇合香丸的質(zhì)量，筆者采取薄層色譜法和高效液相色譜法對(duì)蘇合香丸中11-羥基-β-乙酰乳香酸進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定，以期為蘇合香丸的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters公司高效液相色譜儀（Waters e2695型泵，Waters2998紫外檢測(cè)器）；Sartorius電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Milli-Q A10型超純水儀（密理博公司）；KUDOS SK7510LHG型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品（批號(hào)：111706- 200601；中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純（Fisher公司），水為純化水，乙醇為分析純。蘇合香丸（大蜜丸）：廠家A編號(hào)分別為0023、0041、0144、0145、0173、0188、0189、0194、0195、0196、0197、0377、0448、0449、0461；廠家B編號(hào)分別為0166、0203、0204、0212、0217、0479；廠家C編號(hào)為0185。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 供試溶液的制備 取本品1丸，加硅藻土2 g，研細(xì)，加乙醇15mL，超聲（250W，40kHz）處理20min，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取11-羰基-β-乙酰-乳香酸對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 將不含乳香的藥味按處方比例和制備方法制成陰性對(duì)照，按供試品溶液的制備方法制成不含乳香酸的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 TLC鑒別 照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液2～5μL和對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰乙酸（9∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。

結(jié)果表明，供試品溶液與對(duì)照品溶液在薄層板Rf值相同的位置顯相應(yīng)的熒光猝滅斑點(diǎn)。從結(jié)果可以看出，3個(gè)生產(chǎn)廠家的9批蘇合香丸均檢出11-羥基-β-乙酰乳香酸，但是不同廠家的11-羥基-β-乙酰乳香酸的斑點(diǎn)顏色深淺不同，表明各廠家蘇合香丸中11-羥基-β-乙酰乳香酸的含量不同。如圖1所示。為進(jìn)一步驗(yàn)證薄層色譜的檢驗(yàn)結(jié)果，將3個(gè)廠家22批樣品進(jìn)行乳香主成分11-羥基-β-乙酰乳香酸高效液相色譜含量測(cè)定。

2.2 高效液相色譜法含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫（見(jiàn)表 1）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品、供試品溶液和陰性對(duì)照液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品10丸，大蜜丸剪碎，取4 g，精密稱(chēng)定，精密加入硅藻土2 g，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于半丸的量），精密加入乙醇15 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率300W，頻率50Hz）30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 將不含乳香的藥味按處方比例和制備方法制成陰性對(duì)照，按供試品溶液的制備方法制成不含乳香的陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及方法學(xué)考察

2.2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取樣品（編號(hào)：0194）按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液；精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL，置5mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度制備成濃度為0.2050mg/mL的對(duì)照品溶液，在2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定結(jié)果如圖2所示 。因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為241 nm。

2.2.3.2 屬性與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取空白溶劑、對(duì)照品溶液、供試品溶液及不含乳香的陰性對(duì)照溶液分別進(jìn)樣10 μL。蘇合香丸陰性樣品及空白溶劑色譜圖中，11-羰基-β-乙酰乳香酸的相應(yīng)保留時(shí)間附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照液無(wú)11-羰基-β-乙酰乳香酸成分，此方法合理可行。在2.2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，11-羰基-β-乙酰乳香酸與相鄰其他組分峰分離度為11.2，理論塔板數(shù)以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰計(jì)可達(dá)100000以上，11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的拖尾因子為0.99。如圖3所示。

2.2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置5 mL容量瓶中，分別加乙醇稀釋至刻度制備成濃度為0.0210、0.0510、0.1030、0.2050、0.3080、0.4100、0.5130 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，11-羰基-β-乙酰乳香酸濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.2388×107X-580279，r=0.9997，結(jié)果表明：11-羰基-β-乙酰乳香酸在0.021～0.513 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.4 檢測(cè)限與定量限試驗(yàn) 以信噪比分別為3∶[KG-*3/5]1和10∶[KG-*3/5]1測(cè)得本法的檢出限和定量限分別為0.21 μg/mL和0.63 μg/mL。

2.2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.205mg/mL的對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μL，測(cè)定峰面積，峰面積的RSD為0.5%，表明所用儀器具良好的精密度。

2.2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批的樣品（編號(hào)：0194），分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液各6份，分別精密吸取10μL，在2.2.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算的11-羰基-β-乙酰乳香酸平均值為1.0872mg/g，RSD為1.7%，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（編號(hào)：0194）按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12、18 h進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，峰面積RSD為1.9%，表明樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定，供試品溶液中待測(cè)組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的供試品（編號(hào)： 0194，11-羰基-β-乙酰乳香酸含量為1.0872 mg/g），將11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品溶液分別按供試品中11-羰基-β-乙酰乳香酸含量的80%、100%、120%精密加入，各3份，按供試品溶液制備方法制備高、中、低濃度9份供試品溶液，精密吸取10 μL，依法測(cè)定，本方法回收率在101.60%～104.73%之間，RSD為0.9%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.4 供試品測(cè)定 取3個(gè)廠家共22批供試品（均為大蜜丸），按供試品溶液制備方法制備制成供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，再按2.2.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖（如圖4所示），測(cè)定峰面積，可知11-羰基-β-乙酰乳香酸含量為2.0674 mg/丸～4.1242 mg/丸，平均含量為3.1996 mg/丸。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 薄層色譜法中條件的優(yōu)化 照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液2～5 μL和對(duì)照品溶液5 μL，①分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，②分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰乙酸（9∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，a. 置紫外光燈（254 nm）下檢視，b. 噴以10%的硫酸乙醇后在紫外燈光366 nm和日光下檢視。通過(guò)對(duì)比，結(jié)果表明：①紫外光燈254 nm檢視，斑點(diǎn)清晰；②噴以10%的硫酸乙醇在紫外光燈365 nm檢視，斑點(diǎn)不明顯；③噴以10%的硫酸乙醇日光下檢視，斑點(diǎn)不明顯。由此可以看出：點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，在紫外光燈254 nm檢視方法最好。

3.2 提取時(shí)間考察 取同一批的樣品（編號(hào)：0194），按供試品溶液制備方法制備，分別超聲處理10、20、30、40 min，取出，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，分別精密吸取10 μL，在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算11-羰基-β-乙酰乳香酸含量，含量分別為0.6738、0.6988、1.0872、1.0880 mg/g。因此確定超聲提取時(shí)間為30 min。

乳香、制乳香在現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)中多以測(cè)松香酸來(lái)鑒定其有無(wú)摻偽，測(cè)定乳香藥材、含乳香的中成藥中的11-羰基-β-乙酰乳香酸近幾年才見(jiàn)報(bào)道，本文建立了蘇合香丸中11-羰基-β-乙酰乳香酸的定性定量方法，方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用性良好，可以作為蘇合香丸現(xiàn)行法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的有益補(bǔ)充。

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