李 亮，劉書(shū)東，田 聰，梁維維，康 帥，艾克拜爾·阿不都熱依木

(新疆畜牧科學(xué)院 草業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830000)

優(yōu)良飼草料缺乏是畜牧業(yè)發(fā)展的重要限制因素，特別是北方冷季飼草料短缺，在極端氣候年份，對(duì)農(nóng)牧民會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，開(kāi)展飼草料種植與青貯應(yīng)用可以有效緩解該問(wèn)題[1]。開(kāi)展青貯玉米的選育與推廣工作，有利于實(shí)現(xiàn)糧、飼、經(jīng)三元結(jié)構(gòu)的有機(jī)結(jié)合，有利于解決我國(guó)畜牧業(yè)迅速發(fā)展與飼草料短缺的矛盾[2-3]。我國(guó)青貯玉米育種工作開(kāi)展較晚，青貯玉米種質(zhì)資源的利用率低、種質(zhì)材料匱乏，創(chuàng)新、篩選并改良現(xiàn)有種質(zhì)資源是青貯玉米育種的當(dāng)務(wù)之急[4]。種質(zhì)資源研究是青貯玉米育種的基礎(chǔ)，掌握青貯玉米種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，對(duì)選育優(yōu)良品種具有重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定等分析研究，特別是SNP(單核苷酸多態(tài)性)芯片技術(shù)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，促進(jìn)了以SNP為核心的高通量分型技術(shù)的發(fā)展，推動(dòng)了玉米、水稻等作物在遺傳、種質(zhì)鑒定、分子育種等領(lǐng)域的發(fā)展[5]。SNPs廣泛應(yīng)用于模式動(dòng)物和模式植物的親緣關(guān)系、品種鑒定等研究[6]。王陽(yáng)等[7]使用3K的基因芯片對(duì)黃早四及14份黃改系進(jìn)行遺傳基礎(chǔ)分析，結(jié)果顯示，14個(gè)黃改系與黃早四的相似度比例在90.1%～98.0%。路明等[8]使用SNP標(biāo)記對(duì)玉米品種吉單50的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)吉單50的母本A5001與599-20遺傳關(guān)系最近，父本A5002與鐵7922的遺傳關(guān)系最近。史亞興等[9]使用1059個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)39份糯玉米自交系的親緣關(guān)系和多態(tài)性信息進(jìn)行研究，明確了39份自交系的最小等位基因頻率為0.03～0.50，親緣關(guān)系系數(shù)為0.00～0.91，為糯玉米種質(zhì)資源利用及品種選育打下基礎(chǔ)。但青貯玉米種質(zhì)資源研究較少，種質(zhì)材料信息存在遺傳基礎(chǔ)不明確、親緣關(guān)系不清楚，育種工作存在盲目性的問(wèn)題。試驗(yàn)使用56K的基因芯片對(duì)遺傳信息不明確的34份玉米種質(zhì)材料進(jìn)行分析，期望在分子水平上揭示上述種質(zhì)材料的親緣關(guān)系，為合理利用上述玉米自交系，以及青貯玉米的遺傳選育工作打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

34份供試玉米種質(zhì)材料分為3部分，第1部分為9份籽粒玉米自交系(材料1、6、14、18、21、24、25引種自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，材料19引自海南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，材料22為先玉335親本自交系)；第2部分為5份青貯玉米自交系(材料2、7、11、15引自海南農(nóng)業(yè)科學(xué)院、材料27為大芻草)；第3部分為20份青貯玉米種質(zhì)資源(未知青貯玉米種質(zhì)資源)(表1)。

表1 34份玉米種質(zhì)材料信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 將供試材料種植在新疆呼圖壁縣農(nóng)業(yè)部旱生牧草原種基地內(nèi)，正常田間管理，在玉米開(kāi)花期取新鮮的穗位葉為樣品，使用CTAB法提取葉片基因組DNA[10]。使用紫外分光光度計(jì)和電泳的方法檢測(cè)樣品是否合格，要求樣品無(wú)降解、無(wú)蛋白質(zhì)污染和無(wú)RNA污染，將符合要求的DNA樣品保存在-80℃冰箱中備用(圖1)。

圖1 部分樣品DNA電泳圖Fig.1 The part of 34 maize germplasms DNA electrophoretogram

1.2.2 基因芯片雜交 對(duì)34份玉米種質(zhì)資源進(jìn)行Affymetrix基因芯片雜交(北京中玉金標(biāo)記有限公司)，芯片檢測(cè)的SNP標(biāo)記個(gè)數(shù)為56 000個(gè)(56K)。對(duì)34份核酸樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格的樣品進(jìn)行線(xiàn)性擴(kuò)增，加入擴(kuò)增液后，37℃溫浴22～24 h；DNA片段化，用隨機(jī)內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物；乙醇沉淀DNA，使用高速冷凍離心機(jī)收集目標(biāo)片段，然后加入重懸液和雜交液；對(duì)樣品進(jìn)行變性，變性后立即在GeneTitan MC Instrument進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)；雜交結(jié)束后利用GeneTitan MC Instrument進(jìn)行樣品的洗染和掃描；對(duì)GeneTitan MC Instrument產(chǎn)生的文件利用Axiom Analysis Suit進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以獲得原始數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用Admixture軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，使用數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，確定各種質(zhì)材料的親緣關(guān)系系數(shù)[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 34份種質(zhì)材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析

34份種質(zhì)材料預(yù)期信號(hào)與背景信號(hào)分辨率值都大于82%，樣品數(shù)據(jù)檢出率都大于95%，34份種質(zhì)材料的平均樣品檢出率為97.89%(表2)。可見(jiàn)，34份種質(zhì)材料基因芯片雜交質(zhì)量較好。34份種質(zhì)材料分為2種遺傳類(lèi)型，籽粒玉米種質(zhì)材料1、6、14、18、21、22、24、25屬于一類(lèi)遺傳結(jié)構(gòu)類(lèi)型；青貯玉米種質(zhì)材料2、12、27屬于另一類(lèi)遺傳類(lèi)型，說(shuō)明籽粒玉米種質(zhì)資源和青貯玉米種質(zhì)資源在遺傳學(xué)上具有很大的遺傳差異，這可能是導(dǎo)致上述兩種類(lèi)型的玉米種質(zhì)表型差異的主要原因。大部分未知青貯種質(zhì)資源含有兩種類(lèi)型的遺傳結(jié)構(gòu)，其中青貯種質(zhì)資源的遺傳比例相對(duì)較大(圖1)。

圖2 34份材料遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The genetic structure of 34 maize germplasms注：不同顏色代表不同群體，深色代表青貯玉米，灰色代表籽粒玉米

樣品數(shù)量數(shù)據(jù)檢出率大于95%信號(hào)與背景信號(hào)分辨率值大于82%平均檢出率34343497.89%

2.2 34份種質(zhì)材料的親緣關(guān)系分析

34份種質(zhì)材料中，已知種質(zhì)材料親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，其中，種質(zhì)材料25和27親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，親緣系數(shù)為-8.687 8；大部分未知種質(zhì)材料具有親緣關(guān)系，種質(zhì)材料26和34親緣關(guān)系最近，親緣系數(shù)為0.266 3。通過(guò)親緣關(guān)系系數(shù)的平均值可知，種質(zhì)材料27的親緣關(guān)系系數(shù)平均值最小，說(shuō)明該材料與其他種質(zhì)材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其次是種質(zhì)材料2。根據(jù)各種質(zhì)材料親緣關(guān)系遠(yuǎn)近排列，與其他種質(zhì)材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的前5個(gè)種質(zhì)材料分別是27(-5.000 64)>2(-3.300 79)>25(-1.475 92)>18(-1.35237)>15(-1.21794)。說(shuō)明5個(gè)種質(zhì)材料與其他種質(zhì)資源具有較大的親緣差異。

在未知來(lái)源的玉米種質(zhì)中，除種質(zhì)材料16外，其他都存在一定的親緣關(guān)系。其中種質(zhì)材料23與15個(gè)未知來(lái)源的種質(zhì)材料存在親緣關(guān)系，有10個(gè)種質(zhì)材料與14個(gè)未知來(lái)源的種質(zhì)材料存在親緣關(guān)系。有20對(duì)種質(zhì)材料間存在較大的親緣關(guān)系，其親緣關(guān)系系數(shù)在0.2以上，25對(duì)種質(zhì)材料間存在一定的親緣關(guān)系，其親緣關(guān)系系數(shù)在0.1～0.2。

3 討論

3.1 青貯玉米種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)

掌握種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)信息是掌握種質(zhì)材料遺傳多樣性和親緣關(guān)系的基礎(chǔ)。王文斌等[13]使用2846個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)23份玉米自交系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11個(gè)自交系在遺傳上更接近丹340、鄭58；12個(gè)自交系在遺傳上更接近Mo17、黃早四。吳承來(lái)等[14]使用SSR標(biāo)記對(duì)玉米各類(lèi)群的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)Reid群與旅大紅骨群、PB群的遺傳相似系數(shù)比較大，而與塘四平頭群的遺傳相似系數(shù)比較小。在籽粒玉米遺傳結(jié)構(gòu)研究中種質(zhì)資源會(huì)被劃分多個(gè)亞群[15]，試驗(yàn)中34份玉米種質(zhì)資源被分為2種類(lèi)型，這可能是由于樣本數(shù)量較少以及籽粒玉米和青貯玉米種質(zhì)資源在基因組水平上差異過(guò)大的原因，這也啟示青貯玉米種質(zhì)資源要保存具有青貯玉米特性的基因資源，避免與籽粒玉米遺傳資源大規(guī)?；祀s，有利于提高青貯玉米選育過(guò)程中雜種優(yōu)勢(shì)的利用。

3.2 青貯玉米種質(zhì)的親緣關(guān)系

種質(zhì)資源的引進(jìn)、改良、創(chuàng)新是青貯玉米育種的關(guān)鍵，掌握種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳基礎(chǔ)是種質(zhì)創(chuàng)新的前提條件。趙文明等[16]使用92對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)32份糯玉米自交系親緣關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)自交系T366與其他自交系的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。史亞興等[9]使用1059個(gè)SNP分子標(biāo)記對(duì)39份糯玉米種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)京6和京糯6之間的親緣關(guān)系系數(shù)為0.91；白檽6與BN2次之，親緣關(guān)系系數(shù)為0.82，說(shuō)明2對(duì)自交系親緣關(guān)系較近，而且一些未知來(lái)源的自交系通過(guò)親緣關(guān)系分析也明確了其親緣關(guān)系。這說(shuō)明通過(guò)親緣關(guān)系分析可以準(zhǔn)確掌握各種質(zhì)資源的遺傳信息，可以間接反映該種質(zhì)的遺傳背景情況。試驗(yàn)中使用56K基因芯片對(duì)34份玉米種質(zhì)資源進(jìn)行分析，種質(zhì)27(大芻草)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，通過(guò)對(duì)5個(gè)青貯自交系和未知來(lái)源種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)2，15和27與未知來(lái)源種質(zhì)的親緣關(guān)系差異較大，而種質(zhì)11與未知來(lái)源種質(zhì)的親緣關(guān)系差異較小。因此，未知種質(zhì)資源可能與種質(zhì)11有一定的血緣關(guān)系。種質(zhì)11有籽粒玉米血緣，但青貯玉米血緣偏多。這可能說(shuō)明未知的種質(zhì)資源是籽粒玉米與青貯玉米雜交產(chǎn)生的后代，正在向青貯玉米方向進(jìn)行選擇。種質(zhì)31和34的青貯玉米血緣較多，籽粒玉米血緣較少(圖1)。種質(zhì)31和34與籽粒玉米自交系21，22和24的親緣關(guān)系差異較小，但與籽粒玉米自交系18、25的親緣關(guān)系差異較大。結(jié)合籽粒玉米選育過(guò)程中存在雜種優(yōu)勢(shì)群A群和B群[17]，可以推測(cè)在青貯玉米種質(zhì)和籽粒玉米種質(zhì)進(jìn)行雜交選育二環(huán)系的過(guò)程中，如果雜交使用籽粒玉米屬于已知的一個(gè)群，那么后期通過(guò)該雜交選育的二環(huán)系可能與另一個(gè)群體的自交系親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，這為可能青貯玉米的選育和雜交模式利用提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

使用56K的SNP標(biāo)記對(duì)34份玉米種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)34份玉米種質(zhì)可以分為2種類(lèi)型，分別是籽粒玉米和青貯玉米類(lèi)型，大部分未知青貯種質(zhì)在遺傳結(jié)構(gòu)上具有較大的青貯種質(zhì)遺傳比例，是潛在的青貯玉米種質(zhì)創(chuàng)新材料；種質(zhì)材料27、2、25、18、15與其他種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是潛在的育種材料。