楊小月，陳建明，劉小龍，張 娟，林家仕

(集美大學(xué)體育學(xué)院，福建 廈門361021)

運(yùn)動(dòng)作為一種生理刺激，會(huì)導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生適應(yīng)性改變，如線粒體生物合成和血管增生等。大量的研究表明過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1a(Peroxisome proliferators-activated reptorγ coactivator-1a，PGC-1a)是調(diào)控線粒體生物合成的核心因子，對(duì)其上下游調(diào)控因子的研究也比較成熟。上游主要調(diào)控因子為腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[1]、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)[2]、鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKII)[3]等；下游主要調(diào)控因子為核呼吸因子1(NRF1)、核呼吸因子2(NRF2)等[4]。線粒體生物合成依賴血管為其提供氧氣和能源物質(zhì)，但是目前對(duì)骨骼肌血管合成的研究相對(duì)較少，尤其是與VEGF相關(guān)的具體通路方面。近年來，大量流行病學(xué)調(diào)查和干預(yù)性研究表明，心肺耐力 (cardiorespiratory fitness,CRF)是預(yù)測(cè)心血管和代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)(血壓、血脂、 血糖、肥胖)的獨(dú)立因素，CRF水平越高越有利于降低疾病風(fēng)險(xiǎn)[6]。由于骨骼肌血管合成對(duì)CRF的提高具有重要作用，因此，研究運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌血管合成適應(yīng)將有可能成為揭示高水平的CRF改善代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)因素這一重要理論的關(guān)鍵突破口。大量文獻(xiàn)普遍認(rèn)為VEGF是促進(jìn)骨骼肌血管合成的核心的因子，但卻未見其相關(guān)的調(diào)控通路研究的文獻(xiàn)綜述。為此，本文對(duì)四條主要通過VEGF調(diào)控骨骼肌血管合成的通路的研究成果進(jìn)行綜述，旨在為后來研究者提供理論依據(jù)和研究思路。

1 VEGF與骨骼肌血管合成

參與骨骼肌血管合成因子很多，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)，它是一種強(qiáng)烈的分裂素，作用于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和纖維母細(xì)胞，可以上調(diào)VEGF和一氧化氮(NO)產(chǎn)物[7,8,9]。其他參與血管合成的細(xì)胞因子包括血小板源性生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶類、血纖維蛋白溶酶原、尿激酶、組織纖溶酶原激活物等。這些因子無故溶解將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)完整性消失，微血管功能也將喪失，最終將影響骨骼肌血管合成[10]。

血管合成被多條促血管新生因子所調(diào)控，同時(shí)也被調(diào)節(jié)毛細(xì)血管生成和復(fù)原的因子所調(diào)控[11，12]。在骨骼肌中，維持血管生成和毛細(xì)血管生長(zhǎng)的最重要因子是VEGF[13，14，15]，被認(rèn)為是調(diào)控骨骼肌血管合成的核心因子。目前我們知道VEGF和其他促血管生長(zhǎng)因子過程最初來源于鑒定抽芽式血管合成實(shí)驗(yàn)，而且主要是在骨骼肌中進(jìn)行[16]。肌肉收縮時(shí)，儲(chǔ)存于囊泡中的VEGF被分泌至小間隙[17]，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF受體，通過與其受體VEGFR2結(jié)合促進(jìn)骨骼肌血管合成[18]。也有研究表明，當(dāng)VEGF濃度較低時(shí)，骨骼肌中毛細(xì)血管與纖維比率將下降[19,20]。所以VEGF與其受體對(duì)骨骼肌血管合成作用突出。

2 不同運(yùn)動(dòng)方式與VEGF表達(dá)

不同運(yùn)動(dòng)方式可上調(diào)骨骼肌中的VEGFmRNA和蛋白表達(dá)。運(yùn)動(dòng)方式可分為一次急性運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)。一次急性運(yùn)動(dòng)包括間歇訓(xùn)練(HIT)[21]、持續(xù)性訓(xùn)練(CONT)[22]以及抗阻訓(xùn)練(RE)[23]等；長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)干預(yù)包括到日常體力活動(dòng)[24]和有氧訓(xùn)練[25]等。1996年，Breen EC等對(duì)老鼠肌肉刺激模擬肌肉運(yùn)動(dòng)即刻后，VEGF mRNA上調(diào)了2～4倍，在隨后的4 h也有所增加，8 h后恢復(fù)到安靜狀態(tài)下水平，同時(shí)VEGF蛋白增加和其mRNA增加一致[26]。2008年，Riikka Kivel?等對(duì)48只老鼠進(jìn)行一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)后6小時(shí)，VEGF-A及其受體VEGFR-2mRNA分別增加了25 %和29 %，VEGF-B增加了15%(P=0.05)(如圖1)，表明一次性運(yùn)動(dòng)可有效促進(jìn)老鼠骨骼肌VEGF mRNA表達(dá)[27]。2014年，Patrick Wahl等對(duì)12名受試者進(jìn)行三種運(yùn)動(dòng)方案，試驗(yàn)分別是130 min 55 %最大輸出功率(PPO)、4x4min95%PPO和4x30s 全力(all-out)，發(fā)現(xiàn)三種運(yùn)動(dòng)后VEGF mRNA明顯上升，在運(yùn)動(dòng)后30分期間逐漸減少至運(yùn)動(dòng)前水平，表明運(yùn)動(dòng)均可上調(diào)VEGF(如圖2)，但是該實(shí)驗(yàn)并沒有控制運(yùn)動(dòng)時(shí)間變量[28]。2016年，Conor W.Taylor等控制運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)8名運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行HIT(4x30s最大沖刺，間歇4min)和CON(120 s最大沖刺)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)3小時(shí)后發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA顯著升高，分別提高了3.5倍和4.3倍(P=0.02)(如圖3)，表明運(yùn)動(dòng)方式對(duì)VEGF mRNA表達(dá)影響甚大[29]。

圖1 一次性運(yùn)動(dòng)對(duì)VEGF mRNA和其受體表達(dá)示意圖(引自Kivel? R，2008)

上述對(duì)運(yùn)動(dòng)方式的分析中，發(fā)現(xiàn)不同運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、受試對(duì)象等的差異，造成運(yùn)動(dòng)后VEGF提高的幅度不一樣。目前，大多研究表明HIIT比CON運(yùn)動(dòng)方式對(duì)人體的生理刺激更大，運(yùn)動(dòng)后VEGF提高的幅度應(yīng)該更大，然而Conor W.Taylor等的研究出現(xiàn)相反的結(jié)果：CON(120s最大沖刺)比HIIT(4x30s最大沖刺，間歇4min)提高VEGF mRNA的幅度更大(～4.3 VS ～3.5倍,P = 0.02)。經(jīng)過比較兩種運(yùn)動(dòng)方案分析得出，可能是HIIT的間歇時(shí)間過長(zhǎng)，雖然控制了運(yùn)動(dòng)的時(shí)間，但整個(gè)運(yùn)動(dòng)方案總時(shí)間不相等，后者明顯比前者時(shí)間更長(zhǎng)，這可能是造成HIIT提高VEGF的幅度不如CON的主要原因。另外，骨骼肌能量攝取速率具有強(qiáng)度依賴性，尤其在以有氧代謝為主的運(yùn)動(dòng)中，強(qiáng)度對(duì)加速骨骼肌血管合成速度起至關(guān)重要的作用[30]。因此，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下，信號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)酶的活性必然會(huì)隨強(qiáng)度變化而變化，從而造成VEGF提高的幅度差異。人體實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的受試對(duì)象也存在較大差異，人體實(shí)驗(yàn)受試者的心理和生活條件控制相對(duì)較難，而動(dòng)物大多生活在統(tǒng)一飼養(yǎng)的動(dòng)物房，生活條件容易把控。不同的運(yùn)動(dòng)方式均可上調(diào)VEGF mRNA和蛋白，但是其中的調(diào)節(jié)通路尚不清楚，因此研究運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調(diào)控通路意義重大。

3 運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調(diào)控通路

運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌血管合成蛋白VEGF的調(diào)控通路主要分兩大組，即促進(jìn)組和抑制組。促進(jìn)組包含運(yùn)動(dòng)通過PGC-1家族( PGC-1s)和低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)調(diào)控通路；抑制組包含運(yùn)動(dòng)通過凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)和金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)調(diào)控通路。

3.1 運(yùn)動(dòng)通過PGC-1s調(diào)控骨骼肌血管合成

PGC-1s調(diào)控不同組織的代謝功能[31]，其家族由PGC-1a、PGC-1β和PRC組成。這三個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控者自身沒有調(diào)控活性，但是可以結(jié)合DNA轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)線粒體生物合成、脂肪酸氧化、控制糖異生、血管生成等[32]。

PGC-1s在調(diào)控運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌血管合成中發(fā)揮重要作用。2008年，Zoltan Arany等提出PGC-1a誘導(dǎo)雌激素相關(guān)受體a(ERRa)促進(jìn)VEGF表達(dá)，從而增強(qiáng)老鼠骨骼肌的血管合成，并且指出該通路與低氧誘導(dǎo)HIF-1通路獨(dú)立。文中引出了原本控制線粒體生物合成的因子PGC-1a和ERRa也參與血管合成的表達(dá)，但是并沒有通過實(shí)驗(yàn)完全證明兩者與VEGF絕對(duì)相關(guān)[33]。直到2009年，Chinsomboon J等通過實(shí)驗(yàn)證明了PGC-1a和ERRa與VEGF具有正相關(guān)性，并且首次較為完整地提出了運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌血管合成的通路，即β腎上腺素-PGC-1a-ERRa-VEGF軸。通過分別給老鼠注入生理鹽水(10mg/kg)和propranolol (10mg/kg，一種腎上腺素受體抑制劑)，16小時(shí)自由運(yùn)動(dòng)后發(fā)現(xiàn)注入生理鹽水組的老鼠股四頭肌的PGC-1a和VEGF表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，相反注入propranolol老鼠組被明顯抑制，證明了β腎上腺素調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的PGC-1a和VEGF(如圖4)。為了繼續(xù)觀察PGC-1a是否調(diào)節(jié)腎上腺素對(duì)VEGF的誘導(dǎo)，給PGC-1a敲除的和野生型老鼠注入clenbuterol(一種腎上腺素受體激動(dòng)劑)，6h后取股四頭肌發(fā)現(xiàn)clenbuterol使野生型老鼠的VEGF表達(dá)增加了～2.5倍(p<0.05)，而敲除PGC-1a組的VEGF沒有被誘導(dǎo)，證明了β腎上腺素調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)需通過PGC-1a(如圖5)。通過敲除ERRα實(shí)驗(yàn)證明了PGC-1a調(diào)控VEGF需通過ERRa(如圖6)[34]。此后2011年，Rowe GC等提出PGC-1β(PGC-1β被確定為PGC-1a的同源體[35]，N端激活區(qū)域的40%和C端RNA結(jié)合區(qū)域的48%，許多功能與PGC-1a相似，包括線粒體程序的激活[36])，通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)以促進(jìn)骨骼肌血管合成，這個(gè)過程中需要ERRa的參與，并且獨(dú)立于HIF-1調(diào)控途徑。在聯(lián)合實(shí)驗(yàn)中，骨骼肌細(xì)胞PGC-1β過表達(dá)依賴VEGF，可增加鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和骨骼肌血管密度，豐富了PGC-1s調(diào)控骨骼肌血管合成的體系，同時(shí)從側(cè)面證明了PGC-1s對(duì)骨骼肌血管合成的關(guān)系非常密切。

圖6 敲除ERRa后運(yùn)動(dòng)對(duì)VEGF的影響示意圖

值得一提的是，PGC-1a亞基可精確調(diào)控運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌血管合成的途徑。2014年，Thom R等對(duì)PGC-1a的兩個(gè)特殊亞基進(jìn)行研究指出：編碼PGC-1a的特殊結(jié)構(gòu)為NT-PGC-1a和PGC-1a4，前者強(qiáng)烈地誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和肌管形成，從而使骨骼肌血管增加，然而對(duì)線粒體基因沒有影響；后者轉(zhuǎn)基因表達(dá)也可誘導(dǎo)骨骼肌血管合成。并且通過敲除NT-PGC-1a和PGC-1a4以及HIF-1a后，VEGF對(duì)低氧沒有反應(yīng)，表明以上兩個(gè)亞基參與了PGC-1a調(diào)控的骨骼肌低氧反應(yīng)[36]。但是并沒有說明運(yùn)動(dòng)也是通過NT-PGC-1a和PGC-1a4兩個(gè)亞基發(fā)揮調(diào)控作用，因?yàn)镻GC-1a亞基包括PGC-1a-a、PGC-1a-b、PGC-1a-c、NT-PGC-1a、PGC-1a4。運(yùn)動(dòng)到底通過以上亞基的兩種或幾種促進(jìn)血管合成，我們尚不清楚；此外，哪種強(qiáng)度對(duì)骨骼肌血管合成影響最大，是強(qiáng)度越大合成速率就越大的正相關(guān)性關(guān)系？還是中等強(qiáng)度越大，隨后逐漸減少？我們不得而知，還有待今后進(jìn)一步研究。

3.2 運(yùn)動(dòng)通過HIF-1調(diào)控骨骼肌血管合成

HIF-1有兩種亞基其中HIF-1a被認(rèn)為是分子氧氣感應(yīng)器。當(dāng)氧氣充足時(shí)，持續(xù)合成的蛋白會(huì)被降解，但是當(dāng)氧氣不足時(shí)，HIF-1a就會(huì)被堆積。此外，HIF-1的另一種亞基是HIF-1β，可結(jié)合HIF-1a形成HIF-1，具有消炎、血管合成、脂肪合成、細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)重塑等功能[37]。

目前缺血和缺氧均可激活PGC-1a和HIF-1表達(dá)，從而促進(jìn)骨骼肌血管合成。運(yùn)動(dòng)通過PGC-1a可促進(jìn)血管合成，但是運(yùn)動(dòng)是否通過HIF-1也有如此作用？2004年，Mason SD等通過敲除HIF-1a后，發(fā)現(xiàn)老鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間相比野生型低，從糖酵解供能到有氧供能時(shí)間延長(zhǎng)，而且重復(fù)運(yùn)動(dòng)使敲除老鼠組肌肉損害[38]。這種現(xiàn)象在人體中也觀察到，表明HIF-1在肌肉供能的代謝控制中具有重要作用。2008年Zoltan Arany等研究報(bào)道缺氧激活了HIF-1a和HIF-2a以促進(jìn)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)血管合成[33]。而且通過敲除PGC-1a或敲除HIF-1亞基實(shí)驗(yàn)證明了該途徑不經(jīng)過PGC-1a。從缺氧狀態(tài)下表明，PGC-1a和HIF-1a為兩條不同促進(jìn)骨骼肌血管合成的通路，但是在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下是否通過HIF-1a調(diào)控骨骼肌血管合成？2014年，Paula Rodriguez-Miguelez等通過對(duì)24只老鼠進(jìn)行離心運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)離心運(yùn)動(dòng)促進(jìn)沒經(jīng)過訓(xùn)練的骨骼肌HIF-1a和VEGF表達(dá)增加，但是長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后此表達(dá)程度減緩[39]。證明了HIF-1a確實(shí)參與運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌血管合成中，還指出VEGF通過激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生NO，而NO又促進(jìn)HIF-1a表達(dá)，最終增強(qiáng)VEGF表達(dá)，形成一個(gè)正反饋調(diào)控環(huán)。從文中可以總結(jié)出短暫的運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)HIF-1a和VEGF等促血管合成因子的表達(dá)，而且提出NO參與調(diào)控過程的看法，但是沒有證明其通路的順序，是運(yùn)動(dòng)激活eNOS產(chǎn)生NO，調(diào)控HIF-1a和VEGF，最終促進(jìn)骨骼肌血管合成？還是運(yùn)動(dòng)先促進(jìn)HIF-1a和VEGF表達(dá)，VEGF激活eNOS產(chǎn)生NO，從而再回頭促進(jìn)前者基因表達(dá)從而增強(qiáng)骨骼肌血管合成？其中的通路我們尚不清楚。

3.3 運(yùn)動(dòng)通過TSP-1和TIMP-1抑制VEGF表達(dá)

TSP-1是一種基質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，首次在激活的血小板中發(fā)現(xiàn)，是TSP家族中研究最多的蛋白。TSP家族有五種蛋白：TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5，其中TSP-1和TSP-2結(jié)構(gòu)相似。很多正常細(xì)胞分泌TSP-1，如內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞(惡心膠質(zhì)瘤細(xì)胞)。研究表明，TSP-1對(duì)于毛細(xì)血管生成調(diào)節(jié)很重要，被認(rèn)為可抑制血管生成[40]。敲除TSP-1的老鼠，血管生成相比野生型老鼠更高，表明TSP-1抑制血管生成。而TIMP-1，一種血管生成復(fù)合物，對(duì)骨骼肌的毛細(xì)血管合成調(diào)節(jié)也相當(dāng)重要，其發(fā)生機(jī)制可能是通過矩形金屬蛋白(MMPs)以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的退化，進(jìn)而間接限制毛細(xì)血管生長(zhǎng)。也有研究顯示，TIMP-1表達(dá)對(duì)肌肉活動(dòng)很敏感，短暫的運(yùn)動(dòng)將增加TIMP-1mRNA濃度，從而抑制VEGF表達(dá)[41]。

4 小結(jié)

綜上所述，運(yùn)動(dòng)主要通過四條通路調(diào)控骨骼肌血管合成：PGC-1a-VEGF通路、HIF-1a-VEGF通路、TSP-1-VEGF通路和TIMP-1-VEGF通路。其中PGC-1a-VEGF通路尤為重要，可能影響其他三條通路的調(diào)控作用。若需解決上述關(guān)于是否存在起主導(dǎo)作用的信號(hào)通路的問題，則需要從較高層次或全新的視角提出幾點(diǎn)假說：1)VEGF表達(dá)雖是上述四條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果，但仍存在著起主導(dǎo)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；2) 從動(dòng)態(tài)的劑量(效應(yīng)理論角度分析運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌血管合成中重要的調(diào)控因子之間的相互作用也許大有裨益；3)運(yùn)動(dòng)對(duì)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的激活應(yīng)該是全面的，VEGF一定存在著對(duì)變量(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間)大小的最佳范圍。