朱 潛，姚雪梅，沈 鋒，張世馳，于 娜，高茂林

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，?？?570228)

鯽(Carassiusauratus)屬鯉形目鯉科，肉質(zhì)細嫩營養(yǎng)價值較高，是我國重要食用魚類之一。鰓出血病是淡水魚較嚴重的一種惡性傳染病，主要特征為鰓部腫脹、出血，嚴重者體表點狀充血、鰭基部發(fā)紅、腸道有炎癥、腹腔積水、肝臟發(fā)白。該病最初在2009-2010年零星發(fā)生于江蘇省蘇北射陽縣鯽養(yǎng)殖池塘；次年夏末在鹽城地區(qū)出現(xiàn)較大面積的暴發(fā)，引起大量死亡，甚至蔓延至江蘇各省，對江蘇地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近幾年，該病不僅流行于整個蘇北地區(qū)，同時在東北地區(qū)、華中地區(qū)也零星發(fā)生[1-2]。為避免造成更大的經(jīng)濟損失和社會影響，應(yīng)查明鰓出血病的起因，從而有效地預(yù)防和防治這種疾病。孟思好等[3]2011年8-11月和2012年4-10月，從蘇北地區(qū)部分水產(chǎn)養(yǎng)殖基地患“鰓出血病”銀鯽體內(nèi)分離出5個菌株，但人工感染致病菌的試驗魚卻并未出現(xiàn)與自然條件下 “鰓出血病”相同癥狀，因此提出鰓出血病可能由病毒與細菌混合感染引起。王會聰?shù)萚4]調(diào)查江蘇省射陽縣鹽場區(qū)域的100個養(yǎng)殖場，發(fā)現(xiàn)鯽鰓出血病與溫度密切相關(guān)。吳霆等[5]通過組織病理學(xué)、回歸感染試驗、分子生物學(xué)診斷等研究方法，證實異育銀鯽鰓出血病病原為鯉科皰疹病毒-Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)。

2013年6月，黑龍江省哈爾濱市某鯽養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)嚴重的鰓出血癥。從典型病癥魚體的鰓部中分離到2種致病細菌(Q-120和B-15)，對健康鯽進行人工腹腔注射感染和體外溶血試驗，確定其具有致病性。結(jié)合16S rRNA 基因序列比對及進化樹結(jié)構(gòu)分析，確定了該致病菌的種類和分類地位，旨在為鯽鰓出血病的發(fā)病機理、流行規(guī)律、藥物與免疫預(yù)防技術(shù)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

病鯽：取自哈爾濱某養(yǎng)殖場。經(jīng)解剖觀察，發(fā)現(xiàn)病魚皮膚潰爛有白點，體表、各鰭基部、眼眶等處出血，肛門紅腫；其鰓絲整齊并附有粘液，掀開鰓蓋后發(fā)現(xiàn)有特別明顯的凝血現(xiàn)象。鏡檢發(fā)現(xiàn)鰓絲充血腫脹嚴重或伴有爛鰓，未見寄生蟲的存在(圖1)。

回歸感染試驗魚：健康鯽體重100 g左右，購于哈爾濱某養(yǎng)殖場。

分離與檢測用噬纖維菌培養(yǎng)基、PCR所用引物及試劑、細菌基因組DNA提取試劑盒均由上海生工生物工程有限公司提供。藥敏紙片購自北京天壇中國藥品生物制品檢定所。

圖1 病魚主要特征Fig.1 The major characteristics of diseased fish (A 鰓部具有明顯的凝血現(xiàn)象，B 體表、 各鰭基部等處出血且肛門紅腫，C 鏡檢鰓絲充 血腫脹嚴重并伴有爛鰓(10×))

1.2 致病菌的分離和培養(yǎng)

用75%酒精對具有明顯癥狀病魚表面進行消毒處理，從鰓部取少量組織研磨成糊，加入10 mL 0.5%的無菌生理鹽水混勻，取菌液1 mL，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等稀釋度備用。取100 μL上述每個稀釋度(每個稀釋度取3個平行)接種于噬纖維菌培養(yǎng)基(蛋白胨0.18%，酵母膏0.09%，牛肉膏0.09%，葡萄糖0.09%，碳酸氫鈉0.18%，氯化鈉0.3%，瓊脂2.0%，pH7.0～7.4)平板上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。對初篩的各個單菌落進行純化培養(yǎng)，并記錄單菌落的形態(tài)特征。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 細菌形態(tài)學(xué)鑒定

將平板上兩種優(yōu)勢的典型菌落，分別命名Q-120和B-15菌落。將兩種菌落的細菌進行革蘭氏染色，在光鏡下檢查細菌的形態(tài)特征和染色結(jié)果。另取病魚鰓絲壓片觀察鰓絲粘液中致病細菌的形態(tài)特征，并與從菌落中挑取細菌的形態(tài)特征進行比對。

1.3.2 16S rRNA序列測定和進化樹構(gòu)建

將2種細菌接種于噬纖維菌培養(yǎng)基中，28 ℃震搖 24 h后離心收集菌體，按照細菌基因組 DNA 提取試劑盒說明書提取細菌總 DNA，作為 PCR 模板。利用特異性引物Bac-F2：5 aga gtt tga tca tgg ctc ag 3和Bac-R2：5 acg gct acc ttg tta cga ctt 3進行16S rRNA 基因片段擴增。PCR 反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 20 s，共34個循環(huán)； 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后進行序列測定。將所測序列與GenBank中的序列進行Blast比對，然后從匹配度高的序列中選取部分相關(guān)的16S rRNA序列，用Mega 5.0軟件采用最大似然法(ML法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 回歸感染試驗

將分離出的兩株優(yōu)勢菌Q-120和B-15，純培養(yǎng)于噬纖維菌培養(yǎng)基斜面上，24 h后用無菌生理鹽水制成濃度2.0×108個/mL 的菌懸液進行腹腔注射。取體重100 g左右的健康魚40尾，分成4組進行感染試驗。感染組為3組，分別為Q-120、B-15與兩種菌的混和感染組，注射量為菌懸液0.2 mL/尾；對照組注射無菌生理鹽水0.2 mL/尾。試驗魚飼養(yǎng)在25 ℃的充氣水族箱中，觀察魚的生活及發(fā)病情況。致病后對出現(xiàn)典型病魚的鰓部再進行細菌的分離純化培養(yǎng)，與養(yǎng)殖場的病魚分離菌進行對照。

1.5 致病菌的體外溶血試驗

2%紅細胞懸液的制備：健康魚心臟采血5 mL，置放在有玻璃珠的小試管中，輕微攪拌去除纖維蛋白。將血移入裝有10 mL生理鹽水的離心管中，混勻后2 500 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)3～4次至上清液呈無色透明為止。將洗滌好的紅細胞用生理鹽水配制成2%的細胞懸液，備用。

體外溶血測定：取9支10 mL的試管編號分成9組,其中第1～8組為實驗組，第9組為對照組。每組首先各加入2%紅細胞懸液2.5 mL。第1～4組再依次加入2.5、1、0.5、0.1 mL的Q-120菌懸液(濃度為2.0×108CFU/mL )；第5～8組再按上述濃度梯度依次加入B-15菌懸液(濃度為2.0×108CFU/mL )，最后用無菌生理鹽水將9支試管定容至5 mL，室溫下靜置30 min后，觀察并記錄各組的溶血情況。

1.6 藥物敏感實驗

28 ℃培養(yǎng)過夜的Q-120和B-15液體培養(yǎng)物涂布于噬纖維菌平板，適當干燥后貼藥敏紙片,每皿6片，每種藥物2片平行，28 ℃培養(yǎng)24 h 后測定抑菌圈直徑，按產(chǎn)品說明書判定對藥物的敏感度。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌的分離和形態(tài)觀察

將2種優(yōu)勢菌Q-120、B-15在噬纖維菌培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)現(xiàn)Q-120菌落顏色與培養(yǎng)基的顏色接近呈微黃色，菌落直徑約2 mm，培養(yǎng)48 h后菌落顏色加深為淺黃色，菌層增厚似水滴狀，中間厚，邊緣向四周微擴散，菌落直徑可持續(xù)增大至4 mm左右；菌株B-15菌落顏色為白色，菌落直徑較小約1～2 mm，48 h后菌落顏色為白色，表面光滑，菌落也似水滴狀，菌落直徑可增大至3 mm左右。

試驗分離的2種優(yōu)勢菌Q-120、B-15均為革蘭氏陰性桿菌，菌體兩端鈍圓，稍彎，多數(shù)單個排列，無芽孢，有鞭毛，能運動。在顯微鏡下觀察菌株Q-120長約0.5～2.0 μm，菌株B-15長約0.6～2.5 μm。這與活體鰓絲壓片觀察結(jié)果基本一致。

2.1.2 兩種病原菌16S rRNA基因序列及系統(tǒng)進化關(guān)系

以菌株Q-120的基因組為模板，擴增獲得16S rRNA部分序列，長度為1 451 bp(不計引物長度)，并在Genbank上注冊(登錄號KP313244)。Blast比對后，發(fā)現(xiàn)該序列與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)16S rRNA同源性在99%以上，且與登錄號KJ704986.1的維氏氣單胞菌序列同源性達到100%。采用ML法所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，Q-120菌株與維氏氣單胞菌、維氏溫和氣單胞菌生物變種(A.sobria)聚類處于同一進化分支,可確定該分離菌為維氏氣單胞菌(圖2)。

以B-15的兩個菌株(B-15-1和B-15-2)基因組為模板，擴增獲得16S rRNA部分序列，長度為1 462 bp(不計引物長度)，分別在Genbank上注冊(登錄號：KU949379和KU949380)。Blast比對后，發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank上登錄號為JN644526.1、KC660137.1和KC990811.1的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)16S rRNA同源性高達99%以上，且位于進化樹同一分支，可確定該分離菌為陰溝腸桿菌(圖3)。

圖2 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的氣單胞菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Aeromonas based on 16S rRNA (★為本研究的維氏氣單胞菌，刻度尺上的數(shù)字為遺傳距離)

圖3 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的陰溝腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Enterobacter cloaca based on 16S rRNA (★為本研究的陰溝腸桿菌，刻度尺上的數(shù)字為遺傳距離)

2.2 回歸感染試驗

腹腔注射致病菌的健康魚均出現(xiàn)典型的自然發(fā)病癥狀。感染維氏氣單胞菌(Q-120)病魚起初體表大量潰爛，攝食下降，游動緩慢，尾部明顯短??；3 d后魚開始死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腎臟呈褐色，膽囊腫大，魚鰓腫脹或鰓邊緣潰爛，少數(shù)病魚伴有鰓出血現(xiàn)象，死亡率為90%。感染陰溝腸桿菌(B-15)的病魚起初攝食下降，游動緩慢，頭部、軀干部、尾部等多處潰爛，鰭、鰓部出血；3 d后魚開始死亡，解剖發(fā)現(xiàn)鰓顏色發(fā)紅并伴有明顯凝血現(xiàn)象，腸道萎縮，腹部滲出大量黃色液體，死亡率也為90%，其引起的鰓出血現(xiàn)象較維氏氣單胞菌更為明顯。維氏氣單胞菌與陰溝腸桿菌混合感染的病魚出現(xiàn)了兩種菌感染的所有癥狀，死亡率高達100%。因此可確認維氏氣單胞菌、陰溝腸桿菌兩菌株均為致病菌，而陰溝腸桿菌引起的鰓出血和凝血癥狀更明顯，且兩菌株有協(xié)同作用，即二者混合感染時致病率及死亡率增高。

2.3 致病菌的體外溶血試驗

本試驗考驗不同濃度的維氏氣單胞菌(Q-120)、陰溝腸桿菌(B-15)對健康魚紅細胞的影響。溶血實驗結(jié)果如表1：注射Q-120組0.5 h后就開始溶血，菌濃度越高，溶血程度越高，其1號組出現(xiàn)全溶。與維氏氣單胞菌組相比，陰溝腸桿菌組溶血速率明顯慢很多，12 h后才開始溶血，其溶血程度也是隨菌體濃度增高而加快。對照組未出現(xiàn)溶血。

表1 溶血實驗結(jié)果Tab.1 The result of hemolysis test

注：R-溶血，N-表示不溶

2.4 藥物敏感實驗結(jié)果

從5種藥物的敏感實驗得出，Q-120(維氏氣單胞菌)對氟苯尼考與諾氟沙星敏感，而對其他3種藥都具有耐藥性。Q-120較B-15(陰溝腸桿菌)出現(xiàn)了更強的耐藥性(表2)。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結(jié)果Tab.2 The sensitivity of the isolated strains to test chemotherapentants

注:-為耐藥;+-：弱敏感；+為中度敏感；++為強敏感

3 討論

鯽鰓出血病是近年來新出現(xiàn)的流行范圍廣、死亡率高、危害和損失大的急性病。本研究表明，分離的Q-120、B-15菌株在人工感染試驗中具有較強的致病力，感染的病魚出現(xiàn)與自然患病魚相似的鰓出血等癥狀，本實驗鑒定Q-120為維氏氣單胞菌(A.veronii)、B-15為陰溝腸桿菌(E.cloacae)，兩者均為鯽鰓出血病的致病菌。

維氏氣單胞菌(A.veronii)，隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，是一類革蘭氏陰性桿菌。該菌普遍存在于淡水、污水、淤泥及土壤中，其主要致病因子為氣溶素(aerolysin)、腸毒素(enterotoxin)等，致病范圍極其廣泛，可引起中華絨鰲蟹、錦鯉、斑點叉尾鮰及包括人在內(nèi)的多種哺乳動物感染病癥，已逐漸對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康構(gòu)成嚴重的威脅[6-8]。本研究通過人工感染和體外溶血實驗也證明維氏氣單胞菌對鯽具有很強的致病性。從藥敏試驗也發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌比陰溝腸桿菌具有更強的耐藥性。這說明鯽的大量快速死亡可能更多是因為維氏氣單胞菌的溶血作用。

陰溝腸桿菌(E.cloacae)，屬腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Enterobacter)，廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、水、泥土、植物中均可檢出陰溝腸桿菌，屬人類腸道正常菌種之一，但該種菌也是一種條件致病菌，產(chǎn)毒素，可引起敗血癥等[9]。該種菌容易出現(xiàn)較強的耐藥性，而且可能又是由六個菌群復(fù)合組成[10]。目前國內(nèi)外未見陰溝腸桿菌在魚類上感染致病的報道，本研究首次發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌可寄生于鯽，并能引起出血及腹腔腹水等癥狀。我們的藥敏試驗表明該菌對目前的5種常用藥，1種出現(xiàn)耐藥性，2種是弱敏感。因只是檢測了5種藥敏試紙，所以還需要更大量的藥敏實驗來說明其是否具有多重耐藥性。另外最新的研究顯示這種菌在人類腸道的大量出現(xiàn)可引起非酒精性脂肪肝及肥胖[11]，該研究提示可能這種菌的出現(xiàn)與魚體內(nèi)脂肪的代謝失調(diào)有一定的關(guān)系。

此外體外溶血實驗表明，兩種菌均對魚的紅細胞有較強的溶血作用。人工感染實驗結(jié)果表明兩種病菌均能引起健康魚體表大量潰爛、鰓部凝血、腸道炎癥、腹腔積水等，但陰溝腸桿菌引起的鰓出血癥狀(尤其出現(xiàn)鰓部出血、凝血現(xiàn)象)要比維氏氣單胞菌要明顯很多?；旌细腥緯r，出現(xiàn)典型的鯽鰓出血病的癥狀(鰓部腫脹、出血、凝血，鰭基部發(fā)紅、腸道有炎癥、腹腔積水)，與養(yǎng)殖場現(xiàn)場采集病魚的癥狀吻合，這表明陰溝腸桿菌很可能是一種潛在的機會型致病菌，可協(xié)同其它致病性細菌引起“鰓出血病”綜合征。這一結(jié)果為魚類出血病的有效防治提供了重要的依據(jù)。