全書月，李 忠，梁宏偉，羅相忠，王 丹，鄒桂偉

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢，430223； 2.華中農業(yè)大學水產學院，武漢，430070)

魚類卵巢中的成熟卵粒含有仔魚在卵黃營養(yǎng)階段所需的營養(yǎng)，可以在仔魚攝食外源性營養(yǎng)之前，保證內環(huán)境均衡和發(fā)育[1]。針對魚類營養(yǎng)構成的相關研究多有報道[2-4]，劉玉芳[5]對鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)脂類和脂肪酸組成進行了考察，分析其營養(yǎng)價值；羅永康[6]對鰱肌肉和內臟中脂肪酸的組成進行了分析，發(fā)現其內臟和肌肉中含有較高的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoci acid，DHA)；朱邦科等[7]對鰱早期發(fā)育階段魚體脂肪酸構成變化進行了分析，發(fā)現多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)中以DHA、EPA和花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)為主。脂類是魚類生長發(fā)育過程中的重要營養(yǎng)物質[8]，是魚類卵黃的主要構成物。脂類既是生物體的能源物質，也是構成組織器官生物膜的重要成分[9-11]?；谀戏仅勇腰S積累過程，張耀光等[12]將卵子發(fā)生的時相劃分為卵原細胞期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期、卵黃成熟期等4個時期。朱云林等[13]觀察尼羅羅非魚卵母細胞分期時發(fā)現，性腺發(fā)育至Ⅲ期卵母細胞開始積累卵黃物質；且性腺發(fā)育至Ⅳ期初，卵黃開始充滿卵母細胞。卵黃來源分為內源性和外源性兩種途徑：內源性卵黃發(fā)生是指由卵母細胞自身細胞質合成的卵黃顆粒沉積而成的卵黃物質，卵母細胞中的高爾基體、線粒體、核糖體、內質網等細胞器參與該過程；外源性卵黃發(fā)生是指由卵母細胞外的組織(如肝臟)合成的卵黃蛋白前體—卵黃蛋白原(vitellogenin，Vtg)經血液運輸到濾泡細胞，隨后合成卵黃蛋白(vitellin，Vn)并被加工成卵黃顆粒[14]。

長豐鰱是中國水產科學研究院長江水產研究所培育的鰱新品種[15]，具有生長快、體型好和成活率高的優(yōu)點，深受廣大生產者和消費者的喜愛，但存在繁殖力不高的問題，為弄清長豐鰱的繁殖性能，提高繁殖力，本研究對長豐鰱雌性親魚肝臟和卵巢的營養(yǎng)成分和脂肪酸成分進行了測定和分析，研究其在卵巢發(fā)育后期中卵黃物質的積累變化，為進一步了解繁殖期長豐鰱卵巢和肝臟營養(yǎng)狀況，明確親魚的營養(yǎng)程度，尤其是其脂肪和必需脂肪酸水平，以此來推測親魚的繁殖性能[16-17]，以期為長豐鰱親魚培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

根據鰱的性腺發(fā)育規(guī)律，于2017年3-5月在長江水產研究所潛江長豐鰱繁育基地采集健康雌性長豐鰱親魚，隨機選取4齡親魚各3尾，每隔7 d取樣一次，連續(xù)取樣6周，共18個樣品。測量體長均值為63.5 cm、體重均值為4 800 g，解剖后取肝臟及卵巢，迅速置于-20 ℃冰箱冷凍保存。

依據卵巢的大小、形狀、色澤等不同對性腺成熟度進行劃分[18]。本研究中，所取卵巢分期處于Ⅳ期初、Ⅳ期中、Ⅳ期末、Ⅴ期和產卵。按照取樣時間先后定為發(fā)育階段1、2、3、4、5、6； 其中，每個發(fā)育階段所對應的性腺分期，如表1所示。

表1 每個發(fā)育階段所對應的性腺分期Tab.1 Gonad staging at each developmental stage

注：CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

1.2 測定方法

1.2.1 水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量檢測

按照不同發(fā)育階段，取每條魚肝臟和卵巢分別攪碎混勻后取混合樣品50 g，在-20 ℃條件下短暫保存，用凱氏定氮法測定粗蛋白的含量，索氏抽提法測定粗脂肪含量，水分和灰分分別采用烘干法(100±5)℃和馬弗爐灼燒法(550±15)℃測定。

1.2.2 脂肪酸檢測

脂肪酸分別為不同發(fā)育階段3條魚混合卵巢和肝臟樣品，中國農業(yè)科學院油料作物研究所測試中心測定，并出具檢測報告。

1.2.3 數據分析

利用Microsoft Office 2007、SPSS 22.0軟件進行數據處理，Duncan多重比較進行單因素方差分析，顯著性差異為P<0.05。

2 結果

2.1 卵巢組織學切片觀察

第Ⅳ時相的細胞處于生長期的初級卵母細胞。卵細胞內卵黃物質不斷沉積，卵徑可達770-960 μm(表2)。根據卵黃顆粒沉積的程度，Ⅳ時相又劃分為早、中、晚3個時期。

Ⅳ時相早期的主要形態(tài)特征為卵母細胞直徑約778 μm，細胞質外圍出現卵黃顆粒、卵黃泡，在質膜內緣出現皮層泡。細胞核體積變小，形狀變得不規(guī)則(圖1-1)。

Ⅳ時相中期的主要形態(tài)特征為卵母細胞直徑約864 μm，卵黃顆粒充滿核外空間，接近細胞核的卵黃顆粒和卵黃泡體積較大，部分卵黃顆粒開始融合成卵黃小板；卵膜周圍卵黃泡較小，其中積累的卵黃物質為紫紅色。細胞核中位或偏位，體積進一步變小(圖1-2、圖1-3)。

Ⅳ時相晚期的主要形態(tài)特征為卵母細胞直徑約952 μm，卵黃物質充滿細胞質，卵黃顆粒融合成卵黃小板，多為橢圓形。細胞核體積變小，發(fā)生偏位并逐步移向動物極，細小的核仁分布于細胞核中。放射帶厚度增大(圖1-4)。

第Ⅴ時相的卵母細胞為次級卵母細胞。卵母細胞體積達到最大，細胞直徑約1 064 μm。卵黃顆粒融合成板狀卵黃的趨勢更明顯；細胞核移至動物極，核膜消失，濾泡膜破裂，卵粒跌入卵巢腔，成為游離卵(圖1-5、圖1-6)。

表2 長豐鰱卵巢發(fā)育后期卵母細胞直徑Tab.2 The oocyte diameter of Changfeng silver carp in the late ovarian development period /μm

注：卵母細胞直徑均為3次樣品重復；CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

圖1 長豐鰱卵巢組織切片觀察Fig.1 Histological observations for ovary of Changfeng silver carp注： 1：發(fā)育階段1，Ⅳ期初卵巢(×40)；2：發(fā)育階段2，Ⅳ期中卵巢(×40)；3：發(fā)育階段3，Ⅳ期中卵巢(×40)； 4：發(fā)育階段4，Ⅳ期末卵巢(×40)；5：發(fā)育階段5，Ⅴ期卵巢(×40)；6：發(fā)育階段6，產卵卵巢(×40). O：卵母細胞；N：細胞核；Nu：核仁；YG：卵黃顆粒；YP：卵黃小板；PO：初級卵母細胞；ZR：放射帶；CA：皮層泡

2.2 卵巢和肝臟的營養(yǎng)成分

測定了雌性長豐鰱親本卵巢發(fā)育后期卵巢中水分、蛋白質、脂肪、灰分的含量。隨著性腺發(fā)育，卵巢組織中水分含量逐漸增加，尤其發(fā)育階段6(即產卵階段)水分顯著增多(P<0.05)，所占比例范圍為61.39%～70.06%；卵巢組織中蛋白質含量在前5個發(fā)育階段逐漸增加，在發(fā)育階段6顯著減少(P<0.05)，即蛋白質含量在Ⅳ期-Ⅴ期過程中逐漸上升，在產卵階段含量顯著下降，所占比例范圍為21.28%～27.18%；卵巢中脂肪含量在前5個發(fā)育階段逐漸增多，在發(fā)育階段6顯著降低(P<0.05)，即脂肪含量在Ⅳ期-Ⅴ期過程中逐漸上升，在產卵階段含量顯著下降，所占比例范圍是3.32%～5.66%；卵巢中的灰分含量穩(wěn)定不變。(表3)

隨著性腺發(fā)育，長豐鰱肝臟中水分含量平穩(wěn)增長，所占比例范圍為76.56%～80.52%；肝臟組織中粗蛋白含量基本穩(wěn)定不變；肝臟中粗脂肪含量逐漸下降，尤其是產卵階段顯著下降(P<0.05)，所占比例范圍為0.97%～2.47%；肝臟中的灰分含量基本穩(wěn)定不變。(表3)

表3卵巢發(fā)育后期卵巢和肝臟的營養(yǎng)成分
Tab.3Thenutrientsinovaryandliverduringthelateovariandevelopmentperiod/%

注：水分，灰分，粗蛋白，粗脂肪均為3次樣品重復；CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

2.3 卵巢和肝臟的脂肪酸組成

測定長豐鰱卵巢發(fā)育后期卵巢和肝臟組織中脂肪酸的組成及相對含量。從表4中可知，卵巢和肝臟中主要有21種脂肪酸。其中，有7種飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)，分別是C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0；7種單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)，分別是C14∶1、C15∶1、C16∶1、C17∶1、C18∶1、C20∶0、C24∶1；7種多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，分別是C18∶2、C18∶3、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶6。

不同發(fā)育階段的卵巢中主要脂肪酸有C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶5和C22∶6，其中C16∶0、C18∶1和C22∶6所占比例較大。不同發(fā)育階段的高度不飽和脂肪酸含量無顯著區(qū)別，所占比例范圍是26.4%-29.1%；但是，二十二碳六烯酸(DHA)含量總體上呈上升趨勢；花生四烯酸(AA)含量在性腺發(fā)育的前5個發(fā)育階段呈下降趨勢，在發(fā)育階段6含量上升，即AA含量在性腺發(fā)育的Ⅳ期、Ⅴ期過程中呈下降趨勢，在產卵階段含量上升；花生五烯酸(EPA)含量在性腺發(fā)育的前4個發(fā)育階段呈上升趨勢，隨后呈下降趨勢，即EPA含量在性腺發(fā)育Ⅳ期過程中呈上升趨勢，在Ⅴ期-產卵過程中含量下降。

不同發(fā)育階段的肝臟中主要脂肪酸有C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶4和C22∶6，其中C16∶0、C18∶0和C18∶1所占比例較大。高度不飽和脂肪酸含量在性腺發(fā)育的前5個發(fā)育階段呈下降趨勢，在發(fā)育階段6含量增多；且在高度不飽和脂肪酸中，二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸(AA)、花生五烯酸(EPA)含量在性腺發(fā)育的前5個發(fā)育階段呈下降趨勢，在發(fā)育階段6含量上升，即DHA、AA，EPA含量在性腺發(fā)育的Ⅳ期、Ⅴ期過程中呈下降趨勢，在產卵階段含量上升。

表4 卵巢發(fā)育后期卵巢和肝臟的脂肪酸組成Tab.4 Fatty acid in ovary and liver during the late ovarian development period %

續(xù)表4

注：脂肪酸檢出限0.05%，各脂肪酸檢出結果為相對含量，測量2次樣品，取平均值；CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

3 討論

3.1 卵巢和肝臟的營養(yǎng)成分分析

長豐鰱卵巢發(fā)育后期中卵巢和肝臟的營養(yǎng)成分占總重量的比例關系為：水分>蛋白質>脂肪>灰分。魚類的生化構成主要包含水分、灰分、蛋白質、脂肪、碳水化合物等。其中碳水化合物、蛋白質和脂肪是生物體內能量的主要物質載體，但魚體內的碳水化合物含量大約僅占0.5%，在研究中不作為重點研究指標[19]。

肝臟和卵巢間結果比較：肝臟中的水分含量>卵巢中的水分含量，平均值分別是79.03%和64.70%；肝臟中的粗蛋白含量<卵巢中的粗蛋白含量，平均值分別為13.79%和25.35%；肝臟中的脂肪含量<卵巢中的脂肪含量，平均值分別為1.52%和4.56%，可見性腺發(fā)育過程中親魚脂肪和蛋白質的儲存主要集中在卵巢[20]。

隨著性腺發(fā)育，卵巢中水分含量尤其在產卵階段水分顯著增多(P<0.05)，卵細胞吸水。卵巢內的蛋白質、脂肪含量在Ⅳ期-Ⅴ期過程中逐漸上升，在產卵階段含量顯著下降(P<0.05)，主要是由于卵細胞吸水，粗蛋白和脂肪的相對含量降低，絕對含量不變。肝臟中的粗脂肪含量顯著下降(P<0.05)。研究表明，魚類在卵巢發(fā)育過程中，卵黃物質首先在肝臟中合成，然后轉移至卵巢[21]，卵巢內積累大量卵黃物質，脂類便是卵黃物質積累的主要成分之一。脂肪等營養(yǎng)物質在卵巢內大量蓄積，使卵巢內充滿卵黃顆粒，可為受精卵及胚胎的后續(xù)發(fā)育提供能量和物質保障[22]。

3.2 卵巢和肝臟中脂肪酸組成與分析

長豐鰱肝臟和卵巢脂肪酸相對含量的不同是由組織間生理功能的差別所決定的。肝臟作為消化器官，有儲存并向其他組織供給營養(yǎng)物質的功能，其組織內的脂肪酸構成容易受食物中脂肪酸組成的影響[23]。對于長豐鰱卵巢來說，營養(yǎng)物質的積累和構成不但要滿足卵細胞形態(tài)結構和新陳代謝的需要，還要滿足胚胎發(fā)育以及仔魚成長的需要，所以各種脂肪酸之間合理組成的意義越發(fā)重要。

特殊脂肪酸對胚胎發(fā)育過程中系統的發(fā)生和發(fā)育有著重要作用，如高度不飽和脂肪酸DHA和EPA對魚類的繁殖、生長和發(fā)育都有十分重要的作用[24-25]。繁殖季節(jié)長豐鰱卵巢中DHA含量相當高，這與劉玉芳[10]測得鯉魚卵巢中的情況相似。此階段卵巢中DHA含量大于肝臟中DHA含量，表明長豐鰱親魚在性腺發(fā)育過程中，可能優(yōu)先從肝臟中使用DHA，并選擇性的在卵巢中蓄積。長豐鰱卵巢中DHA含量占總脂肪酸含量的比例較高為12.9%～15.5%，而EPA含量占總脂肪酸含量的比例為6.0%～6.8%，低于DHA含量。許多淡水魚類能將EPA轉化成DHA[26]，DHA含量高于EPA可能與這種轉化有關。長豐鰱卵巢中HUFA含量高于肝臟，尤其是DHA、AA和EPA，這是由于卵巢中富集豐富的HUFA營養(yǎng)可為卵子和胚胎的發(fā)育提供相應的營養(yǎng)[27]。HUFA在卵巢中選擇性的積累規(guī)律，在多種魚類[28-29]及貝類中均得到相應證實[30]。

肝臟是魚類脂類和脂肪酸合成的主要器官，肝細胞通過從食物中攝取磷脂、中性脂肪等，并對脂肪酸進行一系列的分解和合成，進而促進脂肪酸代謝[31]。C16∶0是脂肪酸合成過程中優(yōu)先被合成的脂肪酸之一，因此肝臟中的C16∶0含量很高。本研究中，C16∶0在肝臟中的含量最高為24.6%～33.3%。有研究表明，單不飽和脂肪酸作為能源物質最先被利用[32]。卵巢發(fā)育后期長豐鰱雌性親魚卵巢和肝臟中單不飽和脂肪酸含量豐富，占總脂肪酸含量分別為38.5%～43.1%和33.0%～40.7%。C18∶1在卵巢和肝臟的不飽和脂肪酸中含量最高，占總脂肪酸的含量分別為16.2%～19.8%和20.0%～26.1%，可能是主要的供能物質[33]。

Watanabe等對真鯛(Chrysophrys major)的研究表明，魚類的營養(yǎng)狀況是影響親魚繁殖性能的重要因素[34]。雌魚卵巢的脂類含量及其脂肪酸的構成，對其繁殖能力以及受精后的胚胎發(fā)育具有重要影響[35]。了解親魚卵巢和肝臟的脂肪酸構成，對于確定親魚強化餌料或仔魚開口餌料中脂肪酸營養(yǎng)水平具有一定的指導作用。