阮 瑞，吳金平，李 營，岳華梅，李創(chuàng)舉，喬新美，熊 偉，陳細(xì)華

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

細(xì)菌、古細(xì)菌、病毒、真菌以及原生動(dòng)物等腸道微生物在宿主生長發(fā)育過程中起重要作用，不僅可以促進(jìn)宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)育，還能輔助宿主營養(yǎng)吸收[1,2]。對脊椎動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識主要來源于對哺乳動(dòng)物的研究。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和對腸道微生物重要性的認(rèn)識，有關(guān)魚類腸道微生物的組成、功能、影響因子以及調(diào)控方法等研究也越來越多[2-4]。

細(xì)菌是腸道微生物的最主要組成部分。魚類腸道菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等組成[5-7]。魚類腸道微生物不僅可以分泌多種消化酶(如：蛋白酶、纖維素酶、磷酸酶等)促進(jìn)魚類消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)[8]，而且還可以合成多種維生素，如維生素B12[3]。另外，穩(wěn)定的腸道微生物結(jié)構(gòu)可以有助于保護(hù)魚類免受病原微生物通過腸道侵害[9]。

鱘是目前地球上最古老的輻鰭魚類，被譽(yù)為活化石。鱘肉質(zhì)鮮美，其魚卵制作的魚子醬營養(yǎng)價(jià)值極高。隨著鱘養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，關(guān)于其對氨基酸、脂肪酸、糖類、維生素、礦物元素的需要量進(jìn)行了初步研究，表明不同種類的鱘對蛋白質(zhì)和脂肪需要量以及不同蛋白源和脂肪源的利用率存在差異[10]。但仍缺乏關(guān)于如何提高飼料氮磷利用率以及功能性飼料配制的研究[11]。掌握鱘腸道微生物的確切組成及相應(yīng)功能，將能夠?yàn)楦纳破淠c道微生物類群以促進(jìn)其消化吸收和健康生長、減少氮磷排放等功能性飼料配制提供參考。因此，本研究擬利用16S rRNA擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測序技術(shù)對達(dá)氏鰉(Husodauricus)幼魚腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，為全面深入了解鱘不同種類、不同生長階段的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)提供幫助，也為今后探討鱘腸道微生物在提高免疫力、生產(chǎn)性能、飼料利用率以及蛋白源替代等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與DNA提取

養(yǎng)殖試驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所太湖試驗(yàn)場(湖北荊州)進(jìn)行。使用地下水在玻璃纖維平底圓池(直徑105 cm)中進(jìn)行飼養(yǎng)，每個(gè)養(yǎng)殖池中養(yǎng)殖30尾，共有三個(gè)養(yǎng)殖池。利用實(shí)驗(yàn)室配制的飼料對達(dá)氏鰉幼魚進(jìn)行每天(8:00和15:00)兩次投喂。養(yǎng)殖期間水溫為18～20 ℃。飼養(yǎng)飼料配方如表1所示。4周后每個(gè)養(yǎng)殖池采集2尾共采集6尾達(dá)氏鰉幼魚后腸內(nèi)容物，迅速將樣品放入液氮中凍存1 h后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱長期保存。達(dá)氏鰉幼魚個(gè)體信息如表2所示。樣品DNA提取按照QIAamp?PowerFecal?DNA Kits(QIAGEN，Germany)說明書進(jìn)行操作。

1.2 PCR擴(kuò)增與高通量測序

將提取的DNA樣品送往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行建庫和16S rRNA擴(kuò)增子高通量測序。流程為：利用帶有序列標(biāo)簽的16S V3-V4變異區(qū)引物(341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′，806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)[12,13]對提取樣品DNA 進(jìn)行擴(kuò)增；并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行目的條帶割膠回收以及構(gòu)建測序文庫；最后通過Thermofisher公司的Ion S5TM XL測序系統(tǒng)進(jìn)行單末端高通量測序。

表1 飼料配方及營養(yǎng)成分Tab.1 Formulation and nutrient contents of experimental diets %

表2 樣品信息Tab.2 Information of six H.dauricus

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先使用Cutadapt(V1.9.1)[14]對測序原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)進(jìn)行低質(zhì)量序列剪切和根據(jù)序列標(biāo)簽將得到的序列拆分到每個(gè)樣品，并將序列標(biāo)簽和引物序列去除。然后將上述得到的序列通過UCHIME Algorithm去除嵌合體序列，得到有效序列(Clean Reads)[15,16]。利用Uparse(V7.0.1001)軟件[17]對Clean Reads按相似性為97%進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs)聚類，同時(shí)將含有小于10條Clean Reads的OTUs去除，并選取出現(xiàn)頻次最高的Clean Read作為該OTU的代表序列。隨后用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)[18,19]。最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，利用Qiime(V1.9.1)軟件進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA高通量測序

6尾人工養(yǎng)殖達(dá)氏鰉幼魚后腸內(nèi)容物經(jīng)DNA提取、16S rRNA的V3-V4引物擴(kuò)增及高通量測序，共獲得558 610條Raw Reads和541 575條Clean Reads。每個(gè)樣品的Raw Reads、Clean Reads和平均長度如表3所示。去除不能夠被注釋以及含有小于10條Clean Reads的OTUs，最后每個(gè)樣品以84 436條Clean Reads參與后續(xù)分析。6個(gè)樣本總共被劃分成73個(gè)OTUs，而每個(gè)樣品具體含有的OTUs見表3，共有29個(gè)核心OTUs。通過Qiime軟件計(jì)算每個(gè)樣品的測序深度指數(shù)(Good’s coverage)都大于99.99%(表3)，表明了每個(gè)樣本到達(dá)了足夠的測序覆蓋度且本次檢測到的OTUs也足夠代表該批次抽樣群體。同時(shí)樣本稀釋曲線(Rarefaction curve)趨向平坦表明測序數(shù)據(jù)量是足夠的(圖1)。高通量測序原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI的Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫，收錄號為：PRJNA451304。

表3 高通量測序數(shù)據(jù)基本信息表Tab.3 Summary of high-throughput sequencing from six intestinal contents of H.dauricus

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of OTUs

2.2 達(dá)氏鰉幼魚腸道菌群組成分析

通過對6尾達(dá)氏鰉幼魚腸道內(nèi)容物菌群進(jìn)行物種注釋發(fā)現(xiàn)73個(gè)OTUs主要?jiǎng)澐譃?個(gè)門，分別為厚壁菌門(Firmicutes)占98.253%、梭桿菌門(Fusobacteria)占1.225%、變形桿菌門(Proteobacteria)占0.293%、柔膜菌門(Tenericutes)占0.166%、擬桿菌門(Bacteroidetes)占0.045%、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)占0.011%、放線菌門(Actinobacteria)占0.007%。在門分類水平下，不同樣品中的菌群相對豐度的結(jié)果也表明厚壁菌門在達(dá)氏鰉人工養(yǎng)殖幼魚的腸道內(nèi)容物中占有絕對優(yōu)勢(圖2A)。

在目分類水平下，6個(gè)樣品整體上主要分為7個(gè)目，分別為梭菌目(Clostridiales)占98.216%、梭桿菌目(Fusobacteriales)占1.225%、腸桿菌目(Enterobacteriales)占0.293%、支原體目(Mycoplasmatales)占0.166%、擬桿菌目(Bacteroidales)占0.045%、芽孢桿菌目(Bacillales)占0.026%和乳桿菌目(Lactobacillales)占0.009%。梭菌目、芽孢桿菌目和乳桿菌目都屬于厚壁菌門，但是梭菌目在目分類水平下是絕對優(yōu)勢菌群，其具體在每個(gè)樣品中所占比例如圖2B所示。梭菌科(Clostridiaceae)和狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)是在科和屬分類水平下的優(yōu)勢菌群，分別占各自分類中的98.137%和92.892%。梭菌科在每個(gè)樣品中所占的比例都大于92.5%(圖2C)，狹義梭菌屬在每個(gè)樣品中所占的比例都大于82%(圖2D)。除了優(yōu)勢菌群狹義梭菌屬外，含量相對較多的還有3.99%的分節(jié)絲狀菌(Candidatus_Arthromitus)、1.22%的鯨桿菌屬(Cetobacterium)等(圖2D)。通過對梭菌屬進(jìn)一步進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)絕大部分被注釋到Clostridium colicanis。

圖2 物種相對豐度柱狀圖Fig.2 Relative abundance at phylum,order,family and genus level for the intestinal microbiota from six aquaculture H.dauricus A是在門分類水平上的相對豐度柱狀圖，B是在目分類水平上的相對豐度柱狀圖，C是在科分類水平上的相對豐度柱狀圖， D是在屬分類水平上的相對豐度柱狀圖。橫坐標(biāo)代表樣品，縱坐標(biāo)表示相對豐度。

3 討論

本研究對人工養(yǎng)殖的達(dá)氏鰉幼魚腸道內(nèi)容物菌群組成與多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示每個(gè)樣品按84436條Clean Reads進(jìn)行數(shù)據(jù)抽平處理后，可以劃分為73 OTUs，屬于7個(gè)門，其中厚壁菌門是絕對優(yōu)勢菌群，其余6個(gè)門菌群只占1.75%。已有研究表明大部分魚類的腸道微生物按照相對豐度由大到小主要由變形桿菌門、梭桿菌門、厚壁菌門，以及含量比例較少的擬桿菌門和放線菌門等組成[3,20]，例如：斑馬魚(Daniorerio)[21]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯉(Cyprinuscarpio)[22,23]、褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)、游鰭葉鲹(Atulemate)[20]。但是，大西洋鮭(SalmosalarL.)的腸道微生物主要由厚壁菌門(50%)、變形桿菌門(23.1%)和柔膜菌門(6.9%)組成[24]。在本研究中，人工養(yǎng)殖的達(dá)氏鰉幼魚的腸道內(nèi)容物菌群則以厚壁菌門為最主要的菌群(占到98.253%)，暗示了不同種類的魚類腸道微生物在門分類水平上的組成存在差異。

Liu等[23]對團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、草魚、鱖(Sinipercachuatsi)、翹嘴鲌(Culteralburnus)、鯉、鯽(Carassiusauratus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Hypophthalmichthysnobilis)腸道菌群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，食性可能影響魚類腸道菌群的組成，在屬的水平上，草食性魚腸道中主要以具有降解纖維素功能的梭菌屬、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和纖毛菌屬(Leptotrichia)為主，而在肉食性魚腸道中主要菌群是鯨桿菌屬和產(chǎn)蛋白酶菌(Halomonas)。本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鰉幼魚腸道內(nèi)容物菌群中優(yōu)勢菌群梭菌屬與草食性魚偏相似，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其菌群分布有少量的鯨桿菌屬。這可能是與達(dá)氏鰉食性相關(guān)，因?yàn)轺\魚為亞冷水性、雜食偏肉食性魚類。

鱘魚腸道、胃和肝臟組織含有淀粉酶，能夠利用淀粉、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖等糖類[25-27]。Geraylou等[28]通過飼料添加2%阿拉伯低聚木糖飼喂西伯利亞鱘(Acipenser baerii)12周后，發(fā)現(xiàn)能夠提高西伯利亞鱘短鏈脂肪酸的產(chǎn)生和提高其免疫力，并且能夠增加腸道中乳酸菌和梭菌屬豐度。本研究發(fā)現(xiàn)梭菌屬在達(dá)氏鰉幼魚腸道菌群是絕對優(yōu)勢菌群，達(dá)到92.892%。而試驗(yàn)中飼喂的人工配合飼料中含有16.73%的面粉，可能是造成達(dá)氏鰉幼魚腸道內(nèi)容物含有高豐度的梭菌屬的原因。Greetham等[29]對C.colicanis的功能鑒定發(fā)現(xiàn)其可以利用多種糖分產(chǎn)生乳酸鹽、醋酸鹽、甲酸鹽。而短鏈脂肪酸對宿主腸道健康十分重要[30]。另外，鯨桿菌屬能夠產(chǎn)生大量的維生素B12，并且能夠抑制潛在病原菌生長[31]。而本實(shí)驗(yàn)中達(dá)氏鰉幼魚腸道菌群主要包括梭菌屬，還有少量的鯨桿菌屬，關(guān)于其在達(dá)氏鰉腸道中的具體功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但為今后深入了解鱘魚腸道微生物組成及功能、開展鱘魚飼料添加劑等研究提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用16S rRNA擴(kuò)增子高通量測序方法對6尾在已知飼料配方下飼養(yǎng)4周的達(dá)氏鰉幼魚腸道內(nèi)容物進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)和多樣性分析，結(jié)果表明該飼養(yǎng)條件下的達(dá)氏鰉幼魚腸道微生物的絕對優(yōu)勢菌群屬于厚壁菌門、梭菌目、梭菌科、梭菌屬，此外還包含有分節(jié)絲狀菌、鯨桿菌屬等少量菌群。