劉慧芬，王 靜，黃建美，陳秋鳳，陳蕃錦，馬 曉，朱國(guó)超，宋東縈， 聶國(guó)興，李學(xué)軍

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007)

鳙(Hypophthalmichthysnobilis)又叫花鰱，是我國(guó)著名的四大家魚之一，在我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。鳙的養(yǎng)殖歷史悠久，最早可以追溯到一千多年前的唐代，鳙人工繁殖技術(shù)的成功，更是推動(dòng)了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。根據(jù)2017年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)鳙產(chǎn)量從2007年的213.5萬(wàn)噸增至2016年的348.02萬(wàn)噸，在淡水養(yǎng)殖魚類年產(chǎn)量中位居第四，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[2]。

目前，國(guó)內(nèi)已有許多關(guān)于鳙的遺傳多樣性水平檢測(cè)和種質(zhì)評(píng)估工作。李思發(fā)等[3]利用線粒體DNA分析了長(zhǎng)江中下游鳙群體的多樣性，發(fā)現(xiàn)鳙的遺傳多樣性豐富，但是群體間存在顯著的遺傳差異；張德春等[4]采用RAPD方法分析了長(zhǎng)江中游鳙自然繁殖群體和人工繁殖群體的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)人工繁殖群體的遺傳多樣性明顯低于自然群體；張敏瑩等[5]研究了長(zhǎng)江下游鳙放流群體和天然捕撈群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)放流群體與天然捕撈群體間的遺傳多樣性相差不大；耿波等[6]利用17個(gè)鳙微衛(wèi)星標(biāo)記分析了四川瀘州和江西鄱陽(yáng)湖兩個(gè)鳙種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)地理種群間存在種群內(nèi)變異；嚴(yán)駿驄等[7]運(yùn)用AFLP技術(shù)分析了中國(guó)土著鳙群體和移居群體間的遺傳結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)移居群體的遺傳多樣性顯著低于國(guó)內(nèi)土著群體，出現(xiàn)顯著分化。這些研究主要集中在湖北、湖南、廣東、四川、江西、黑龍江等地區(qū)，但至今尚未有關(guān)于河南省鳙遺傳背景的研究報(bào)道。

鳙作為河南重要經(jīng)濟(jì)魚類之一，市場(chǎng)需求量較大，既有本地自繁苗種，也有從廣東、湖北、安徽、天津等地引進(jìn)苗種。為了厘清河南地區(qū)養(yǎng)殖鳙群體的遺傳背景，切實(shí)做好親本遺傳管理工作，對(duì)河南地區(qū)鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)勢(shì)在必行。

目前關(guān)于鳙遺傳多樣性的分析多采用DNA分子標(biāo)記，但至今尚未有基于線粒體COI基因(細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ)分析鳙遺傳背景的研究報(bào)道。COI基因作為線粒體DNA上較為保守的序列,被認(rèn)為是研究群體遺傳多樣性非常有效的工具。因此，本研究利用線粒體COI基因?qū)幽鲜〉?1個(gè)鳙養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，研究不同群體鳙的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在為河南省鳙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料采集與處理

鳙樣本于2016年8-10月間分別取自河南省11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(樣品具體采集地點(diǎn)見(jiàn)表1)。每個(gè)群體隨機(jī)選15尾，剪取部分肌肉組織保存在95%酒精中，用于總DNA提取。

表1 養(yǎng)殖鳙樣品信息

1.2 DNA提取

基因組DNA的提取采用酚-氯仿法，具體步驟如下：取100 mg 左右肌肉組織，加入495 μL裂解緩沖液(1mol/L Tris-HCl 25 μL，0.5 mol/L EDTA 50 μL，NaCl 5 mol/L)，5 μL 蛋白酶K(濃度為 20 mg/mL)，55 ℃恒溫水浴鍋消化2～3 h。加入等體積的飽和酚，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)15 min，12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液(24∶1)，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)10 min后，12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液，加入800 μL提前預(yù)冷的無(wú)水乙醇(-20 ℃)沉淀DNA，70%乙醇洗滌一次，干燥，加入適量ddH2O溶解。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，Nanodrop 2 000檢測(cè)DNA濃度，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

用于擴(kuò)增mtCOI序列的引物來(lái)自Ivanova等[8]，具體序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)總體系25 μL，其中包括Buffer 2.5 μL，Mg2+2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 實(shí)驗(yàn)中所用引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序完成后，DNA序列用CLUSTALX 1.81軟件[9]進(jìn)行比對(duì)；用DNAsp 5.0軟件[10]統(tǒng)計(jì)核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)和群體遺傳分化系數(shù)(FST)。通過(guò)PMAL4.3軟件[11]和Adaptive Evolution Server在線平臺(tái)(http://datamonkey.org//dataupload.php)檢測(cè)鳙養(yǎng)殖群體線粒體COI基因受選擇情況，用非同義替代率(dN)與同義替代率(dS)的比值來(lái)估算選擇壓力。用ARLEQUIN 3.1軟件[12]進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)；用MEGA 4.0軟件[13]的Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算單倍型之間的遺傳距離，并按照鄰接法(neighbor joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)各節(jié)點(diǎn)支持率采用Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)置信度；用TCS 1.2軟件[14]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 鳙群體線粒體COI序列和遺傳多樣性分析

對(duì)采自河南地區(qū)11個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的鳙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得線粒體COI序列，去除兩端引物后，得到的目的片段長(zhǎng)度為652 bp。經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)鳙各群體堿基含量差別不大，A、T、C、G平均含量分別為25.3%、29.5%、27.3%、17.9%，A+T含量(54.8%)高于C+G含量(45.2%)。165尾鳙樣品共檢測(cè)到7個(gè)基因變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)5個(gè)，單突變位點(diǎn)2個(gè)。鳙群體中檢測(cè)到了14個(gè)單倍型(表3)，其中群體間共享單倍型10個(gè)，特有單倍型4個(gè)。各群體單倍型多樣性范圍在0.714 29～1.000 00之間，其中單倍型多樣性最高的是5號(hào)群體，最低的是8號(hào)群體；核苷酸多樣性范圍在0.001 27～0.003 24之間，其中核苷酸多樣性最高的是5號(hào)群體，最低的是2號(hào)群體?；蛄鞣治鲲@示11個(gè)鳙養(yǎng)殖群體間的平均基因流為5.01。

2.2 鳙群體間的遺傳分化與遺傳距離

用ARLEQUIN 3.1軟件計(jì)算不同養(yǎng)殖場(chǎng)鳙群體間的遺傳分化(表4)，結(jié)果顯示鳙兩兩群體間遺傳分化系數(shù)(FST)值在-0.166 67～0.275 08間，有1組發(fā)生極大的遺傳分化(FST>0.25)，6組發(fā)生較大的遺傳分化(0.15

對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)鳙群體進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，結(jié)果顯示(表5)鳙群體主要的變異來(lái)自群體內(nèi)(97.65%)，群體間變異所占比例較低，僅為4.60%，并且3組分子遺傳變量間的差異均未達(dá)到顯著水平。

表3 河南省鳙養(yǎng)殖群體遺傳多樣性信息

注：Hd為單倍型多樣性，π為核苷酸多樣性。

表4 養(yǎng)殖鳙群體間遺傳分化系數(shù)(FST，對(duì)角線下方)和遺傳距離(D，對(duì)角線上方)

*表示差異顯著(P<0.05)。

表5 養(yǎng)殖鳙群體AMOVA分析

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析不同養(yǎng)殖場(chǎng)鳙群體間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果顯示11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的鳙群體交叉聚在一起，沒(méi)有形成明顯的地理格局分布(圖1)。

通過(guò)單倍型網(wǎng)絡(luò)分析，可以看出14個(gè)單倍型在各群體中的分布情況以及單倍型之間的演化關(guān)系。共享單倍型散布在不同的養(yǎng)殖群體中，沒(méi)有按照地理區(qū)域聚類，這一結(jié)果進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析結(jié)果(圖2)。

圖1 基于mtCOI基因構(gòu)建河南地區(qū)養(yǎng)殖鳙NJ樹(shù)

圖2 TCS計(jì)算mtCOI基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 選擇壓力分析

為檢驗(yàn)是否有選擇壓力作用在人工養(yǎng)殖鳙群體上，通過(guò)PAML軟件對(duì)11個(gè)鳙養(yǎng)殖群體的線粒體COI基因進(jìn)行選擇壓力分析和位點(diǎn)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除5號(hào)群體外，所有養(yǎng)殖群體的dN/dS比值均為0，表明在這些群體中，所有核苷酸的替換均為同義替換，沒(méi)有出現(xiàn)氨基酸的改變。當(dāng)把11個(gè)群體混為一組時(shí)，檢測(cè)到83號(hào)位點(diǎn)的dN/dS比值為0.17(P>0.05)，群體受負(fù)向選擇影響。綜上所述，鳙養(yǎng)殖群體的線粒體COI基因主要受到負(fù)向選擇影響，沒(méi)有受到正選擇作用。

3 討論

3.1 河南省鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是評(píng)價(jià)物種資源狀況的重要依據(jù)之一，決定了物種的生存力和適應(yīng)性，是優(yōu)良性狀選育的基礎(chǔ)[15,16]。本研究采集的河南省鳙養(yǎng)殖個(gè)體有來(lái)自湖北、廣州、安徽、天津的苗種，也有本地自繁種群，基本上代表了河南省養(yǎng)殖鳙種質(zhì)資源狀況。利用線粒體COI基因?qū)?1個(gè)鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，165尾鳙樣品中共檢測(cè)到14個(gè)單倍型，其中群體間共享單倍型10個(gè)，特有單倍型4個(gè)。這4個(gè)特有單倍型中，hap11和hap12為本地自繁苗種所特有，hap2為湖北苗種所特有，hap14為天津苗種所特有，廣州和安徽鳙群體沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特有單倍型。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的兩個(gè)重要參數(shù)。在本研究中，11個(gè)群體的平均單倍型多樣性為0.862 37，平均核苷酸多樣性為0.002 23；其中，5號(hào)群體(本地自繁)各參數(shù)值最高，2號(hào)群體(廣州)和8號(hào)群體(河南駐馬店)各參數(shù)值較低。本研究11個(gè)群體的遺傳多樣性整體要高于單淇等[17]報(bào)道的江西瑞昌(Hd為0.6883，π為0.00511)、湖南長(zhǎng)沙(Hd為0.237 9，π為0.001 91)和天津?qū)幒?Hd為0.445 9，π為0.006 67)三個(gè)鳙群體。這也可能與所選分子標(biāo)記不同，線粒體DNA不同區(qū)段的進(jìn)化速率差異有關(guān)。

鳙在河南省的養(yǎng)殖模式主要為池塘混養(yǎng)中搭配養(yǎng)殖，但是近年來(lái)由于價(jià)格提升，才開(kāi)始增加養(yǎng)殖量。5號(hào)群體和8號(hào)群體雖然都是人工繁殖群體，但是8號(hào)群體遺傳多樣性明顯低于5號(hào)群體。養(yǎng)殖群體表現(xiàn)出單倍型多樣性貧乏，遺傳多樣性偏低，反映其育苗親本數(shù)量少。人工養(yǎng)殖條件下依靠少量親本進(jìn)行多代的連續(xù)繁殖，容易導(dǎo)致群體發(fā)生瓶頸效應(yīng)和近交衰退現(xiàn)象，致使其遺傳多樣性水平出現(xiàn)下降。

AMOVA分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖鳙的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)(97.65%)，群體間的遺傳差異較低。養(yǎng)殖鳙群體的NJ系統(tǒng)樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均未檢測(cè)到明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)。NJ聚類樹(shù)發(fā)現(xiàn)湖北、廣州、安徽、天津以及河南本地鳙群體間存在著較多的交叉和滲透。11個(gè)群體單倍型網(wǎng)絡(luò)聚類關(guān)系與NJ聚類的結(jié)果類似，各群體單倍型基本交叉在一起。產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能是人工繁殖造成的結(jié)果。養(yǎng)殖群體在選育過(guò)程中是以經(jīng)濟(jì)性狀為目標(biāo)，各養(yǎng)殖群體在選育過(guò)程中部分親本的遺傳背景可能存在交叉[18,19]。因此，在鳙繁育工作中，需要加強(qiáng)親本的遺傳背景檢測(cè)，選擇遺傳變異高的個(gè)體作為親本，才能保證人工繁殖后代遺傳多樣性和養(yǎng)殖性能。

3.2 鳙養(yǎng)殖群體的選擇壓力

遺傳、變異和選擇是生物進(jìn)化的主要?jiǎng)恿20]。對(duì)于大多數(shù)養(yǎng)殖魚類群體，在人工繁殖和養(yǎng)殖過(guò)程中，包含著有意或無(wú)意的選擇?；蛩艿降倪x擇壓力往往只表現(xiàn)在部分位點(diǎn)上，而不會(huì)表現(xiàn)在整條基因序列上[21]。選擇壓力位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果表明，人工養(yǎng)殖鳙群體線粒體COI基因上留下了選擇信號(hào)。通常認(rèn)為非同義突變(dN)與同義突變(dS)的比值大于1，基因受正向選擇的影響；dN/dS的比值小于1，基因受純化或負(fù)向選擇的影響[22]。本研究中鳙所有養(yǎng)殖群體線粒體COI基因的dN/dS比值均小于1，說(shuō)明鳙養(yǎng)殖群體主要受到純化選擇影響。從進(jìn)化的角度看，群體遺傳變異是自然環(huán)境與人工選擇共同作用的結(jié)果。在自然環(huán)境條件下，沒(méi)有巨大環(huán)境變化時(shí)更多受到的是純化選擇[23]。養(yǎng)殖鳙群體的壓力分析結(jié)果，暗示當(dāng)前的人工選擇對(duì)鳙線粒體基因的作用有限。

本研究選用線粒體COI基因檢測(cè)選擇壓力。線粒體COI基因編碼細(xì)胞色素氧化酶，是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員。Liu等[24]分別用線粒體基因和核基因檢測(cè)了鰍超科魚類的選擇壓力，發(fā)現(xiàn)線粒體COI基因受負(fù)向選擇的影響最大。因此，下一步研究我們將選擇更多的基因去證實(shí)養(yǎng)殖鳙群體受到的選擇作用。

綜上所述，本研究中河南省11個(gè)鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳分化差異較大，遺傳背景存在交叉。鳙作為我國(guó)主要的養(yǎng)殖魚類之一，不同地區(qū)間的引進(jìn)和交流比較頻繁。人工養(yǎng)殖鳙需要優(yōu)良種質(zhì)，但是不當(dāng)?shù)囊N和人工養(yǎng)殖會(huì)使鳙群體出現(xiàn)種質(zhì)混雜和優(yōu)良種質(zhì)退化現(xiàn)象。基于此，建議苗種繁育場(chǎng)在引進(jìn)苗種時(shí)要對(duì)其遺傳背景進(jìn)行考察分析，建議加大引種的數(shù)量與范圍，打破瓶頸效應(yīng)；另外一方面，人工繁殖時(shí)建議進(jìn)行優(yōu)良親本選育，增加繁殖親本數(shù)量，采取家系選育技術(shù)提高選育效率，避免近交衰退帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)并有利于保持鳙苗種的遺傳多樣性。