杜巖巖，婁忠玉，張艷萍,李 文，王 太

(甘肅省水產(chǎn)研究所，甘肅省冷水性魚類種質(zhì)資源與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030)

網(wǎng)箱養(yǎng)殖模式具有高密度、高產(chǎn)量、高收益等特點(diǎn)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖方式之一，然而在投喂飼料中僅有28%的氮和30%的磷被養(yǎng)殖對(duì)象吸收利用[1,2]，大量的投喂殘餌和魚類排泄物等外源有機(jī)質(zhì)進(jìn)入養(yǎng)殖水體，加劇水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)富集程度，直接影響?zhàn)B殖水域功能的正常發(fā)揮。在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，浮游細(xì)菌既是有機(jī)物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者，又是能量的貯存者，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖環(huán)境的變化密切相關(guān)。由于只有很少的浮游細(xì)菌可以進(jìn)行常規(guī)分離培養(yǎng)，這制約了對(duì)浮游細(xì)菌多樣性和生態(tài)功能方面的研究?；诿馀囵B(yǎng)的變性梯度凝膠電泳、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和分子克隆文庫(kù)等分子生物學(xué)方法被應(yīng)用到對(duì)水體浮游細(xì)菌多樣性的研究中，特別是近年來，基于16S rRNA的高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，能更加全面反映出細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的基本特征。陶玲等[3]采用高通量測(cè)序技術(shù)比較了施用生石灰前后精養(yǎng)池塘浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化，為生石灰調(diào)控池塘水質(zhì)和疾病預(yù)防提供可能的理論解釋。胡常巨等[4]對(duì)象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌群落進(jìn)行分析得出網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)增加的磷酸鹽和銨鹽是驅(qū)動(dòng)浮游細(xì)菌群落變異的主要環(huán)境因子。Yan等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了三峽大壩建設(shè)對(duì)香溪河浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的影響。

劉家峽水庫(kù)作為西北重要的冷水魚類養(yǎng)殖基地和周邊城市重要的核心水源地，其生態(tài)環(huán)境狀況直接關(guān)系到養(yǎng)殖安全和飲水安全。以往的研究主要是水環(huán)境[6]、浮游動(dòng)植物[7]和漁業(yè)資源[8]等方面，有關(guān)浮游細(xì)菌生物多樣性和群體結(jié)構(gòu)方面的研究還未見有報(bào)道。本研究采用基于16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌群落多樣性的影響，探討群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系，以期闡明劉家峽水庫(kù)網(wǎng)箱對(duì)水環(huán)境影響的機(jī)理，為水環(huán)境保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定

圖1 劉家峽水庫(kù)采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Distribution of the sample sites in Liujiaxia Reservoir

1.2 DNA提取與高通量測(cè)序

分別用0.22 μm孔徑無菌濾膜抽濾1 L水樣，將濾膜剪碎，用Water DNA kit(Omega)提取總DNA，將提取到的細(xì)菌總DNA通過微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000,wilmingtong,DE,USA)測(cè)定DNA濃度和純度。采用通用引物對(duì)浮游細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司利用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)群落DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用QIIME軟件(quantitative insights into microbial ecology，v1.8.0)對(duì)原始序列進(jìn)行過濾，剔除嵌合體序列，得到優(yōu)化序列，調(diào)用UCLUST序列比對(duì)工具，將優(yōu)化序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列[9]，通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列相比對(duì)，獲取每個(gè)OUT所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。利用軟件mothur計(jì)算豐富度指數(shù)Chao1和ACE，以及多樣性指數(shù)Simpson 和Shannon 指數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性分析[10]。應(yīng)用冗余分析方法(redundancy analysis，RDA)分析浮游細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 浮游細(xì)菌群落豐度、多樣性

6個(gè)樣品的高通量測(cè)序共得到178 176條高質(zhì)量序列，序列平均長(zhǎng)度為393 bp，測(cè)序結(jié)果能完全反映不同樣品浮游細(xì)菌群落組成。按97%的序列相似度進(jìn)行劃分后與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共得到1 310個(gè)OTUs。各采樣點(diǎn)的OTU數(shù)量見表1。其中水庫(kù)上游A1采樣點(diǎn)的OTU最高為700，下游A3采樣點(diǎn)的OTU最低為505。Chao1和ACE指數(shù)主要用于估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，數(shù)值越大，表明群落豐富度越高。水庫(kù)上游A1采樣點(diǎn)的Chao1和ACE指數(shù)最高，分別為509和644.72，A3采樣點(diǎn)的Chao1和ACE指數(shù)最低，分別為383和383.00。Simpson指數(shù)對(duì)群落均勻度和群落中的優(yōu)勢(shì)OTU更敏感，而Shannon指數(shù)對(duì)群落均勻度和群落中的稀有OUT更敏感。位于養(yǎng)殖區(qū)的A1采樣點(diǎn)的Simpson和Shannon指數(shù)最高，其次為位于水庫(kù)上游的A2采樣點(diǎn)，位于養(yǎng)殖區(qū)A6采樣點(diǎn)的Shannon指數(shù)最低。

表1 劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌群落豐度與多樣性Tab.1 The community abundance and diversity of bacterioplanktonic in Liujiaxia Reservoir

2.2 浮游細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)分析

劉家峽水庫(kù)6個(gè)采樣點(diǎn)的1 310個(gè)OTUs分屬于11個(gè)門25個(gè)綱41個(gè)目62個(gè)科73個(gè)屬。在浮游細(xì)菌門分類水平上(圖2)，主要浮游細(xì)菌群落為變形菌門(Proteobacteria)占總浮游細(xì)菌OTUs的30.9%～59.2%，放線菌門(Actinobacteria)總浮游細(xì)菌OTUs的23.4%～34.1%，藍(lán)藻門(Cyanobacteria)總浮游細(xì)菌OTUs的4.8%～20.6%，擬桿菌門(Bacteroidetes)總浮游細(xì)菌OTUs的5.3%～19.8%，這4個(gè)菌門的浮游細(xì)菌占總OTUs數(shù)的92.5%～96.2%，是劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。此外還檢測(cè)到了疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、綠菌門(Chlorobi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)和浮霉菌門(Planctomycetes)。

由圖2可以看出，劉家峽水庫(kù)上游采樣點(diǎn)A1和A2具有相似的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，4種優(yōu)勢(shì)菌落群落相對(duì)豐度比例基本相似。養(yǎng)殖區(qū)A5采樣點(diǎn)的浮游細(xì)菌群落與A1和A2差異較大，變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度達(dá)到59.2%，是所有采樣點(diǎn)中所占比例最大的。放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度都降低，分別為23.4%、4.6%和5.3%，厚壁菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度明顯提高，達(dá)到3.4%。養(yǎng)殖區(qū)A6采樣點(diǎn)與劉家峽水庫(kù)上游A1和A2采樣點(diǎn)相比，擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度明顯提高，達(dá)到19.8%。A3和A4采樣點(diǎn)由于分別位于兩個(gè)養(yǎng)殖區(qū)的下游，呈現(xiàn)出一種水庫(kù)上游來水與養(yǎng)殖用水混合后的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。受網(wǎng)箱養(yǎng)殖的影響劉家峽水庫(kù)上游至下游的浮游細(xì)菌群落中，變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度升高，藍(lán)藻門(Cyanobacteria)的相對(duì)豐度降低。

圖2 劉家峽水庫(kù)各采樣點(diǎn)浮游細(xì)菌門水平組成變化Fig.2 Relative abundances of bacterial phyla in Liujiaxia Reservoir

在屬水平上對(duì)6個(gè)采樣點(diǎn)浮游細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的變化進(jìn)行分析(圖3)，將平均豐度低于1.5%的屬合并為Others。ACK-M1-norank是浮游細(xì)菌群落平均豐度最大的屬，為18.1%，其次為聚球藻屬(Synechococcus)平均豐度為12.2%。相對(duì)劉家峽水庫(kù)上游A1和A2采樣點(diǎn)，在養(yǎng)殖區(qū)A5采樣點(diǎn)鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的相對(duì)豐度達(dá)到最大，為40.6%，紅球菌屬(Rhodococcus)和黃桿菌屬(Flavobacterium)相對(duì)豐度也升高，分別達(dá)到5.3%和1.2%，其余各屬相對(duì)豐度降低。養(yǎng)殖區(qū)A6采樣點(diǎn)β變形菌Limnohabitans屬和黃桿菌屬(Flavobacterium)的相對(duì)豐度升高，分別達(dá)到12.1%和9.7%，其中黃桿菌屬的一些種類可引起虹鱒幼魚患細(xì)菌性并發(fā)癥，聚球藻屬(Synechococcus)和Pelagibacteraceae-uncultured的相對(duì)豐度降低，為10.8%和6.8%。在A3和A4采樣點(diǎn)中，除上游來水與網(wǎng)箱養(yǎng)殖水混合后所表現(xiàn)出的群落組成特征外；A3采樣點(diǎn)中Caulobacteraceae-uncultured的相對(duì)豐度顯著增加，達(dá)到19.70%；A4采樣點(diǎn)的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)的相對(duì)豐度顯著增加，達(dá)到22.4%。

圖3 劉家峽水庫(kù)各采樣點(diǎn)浮游細(xì)菌屬水平組成變化Fig.3 Relative abundances of bacterial genera in Liujiaxia Reservoir

2.3 浮游細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

3 討論

3.1 網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌多樣性影響

本研究利用基于Illumina Miseq平臺(tái)的高通量測(cè)序分析了網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌多樣性的影響分析，共得到了平均長(zhǎng)度為393 bp的178 176條高質(zhì)量序列，發(fā)現(xiàn)主要有變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門等11個(gè)門，ACK-M1-norank、聚球藻屬、鞘氨醇單胞菌屬、紅球菌屬、β變形菌屬和Pelagibacteraceae-uncultured等73個(gè)屬組成，表現(xiàn)出豐富的浮游細(xì)菌群落多樣性。與滇池[11]和丹江口水庫(kù)[12]等淡水湖庫(kù)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門組成基本相似，但是在屬水平上劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌種類數(shù)量較少，這可能與劉家峽水庫(kù)位于高原地區(qū)，水溫較低不利于浮游菌類的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。養(yǎng)殖區(qū)域(采樣點(diǎn)A5和A6)浮游細(xì)菌的多樣性指數(shù)低于非養(yǎng)殖區(qū)，這可能是由于網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域的營(yíng)養(yǎng)鹽和有機(jī)污染物濃度較高，對(duì)水體浮游細(xì)菌有選擇作用，導(dǎo)致養(yǎng)殖區(qū)域的浮游細(xì)菌多樣性較低[13]。在養(yǎng)殖水體中維持浮游細(xì)菌的多樣性可以增強(qiáng)水環(huán)境生物群落穩(wěn)定性，當(dāng)多樣性指數(shù)由高向低轉(zhuǎn)變后，就會(huì)增大養(yǎng)殖病害的爆發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[14]。

表2 劉家峽水庫(kù)采樣點(diǎn)水化學(xué)指標(biāo)Tab.2 Chemical parameters of sample sites in Liujiaxia Reservoir

圖4 劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌屬分類群落與水化學(xué) 指標(biāo)的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of bacterial genus and chemical parameters in Liujiaxia Reservoir

3.2 網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

浮游細(xì)菌在水域生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，不同菌群有其獨(dú)特的生態(tài)功能。由結(jié)果分析可知，放線菌門為劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群，在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)A5采樣點(diǎn)中相對(duì)豐度有所降低，但是該門中的紅球菌屬相對(duì)豐度是所有采樣點(diǎn)中最高的，該屬具有較強(qiáng)的降解碳水化合物和含氮化合物等有機(jī)物的能力[15],這可能是由于網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)岸邊有大量農(nóng)田，部分農(nóng)藥隨地表徑流進(jìn)入水體，導(dǎo)致該區(qū)域紅球菌屬相對(duì)豐度升高。擬桿菌門在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)A6相對(duì)豐度最高，由圖3可以看出主要是由于擬桿菌門的黃桿菌屬在該養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)，并且相對(duì)豐度較高，達(dá)到9.7%。黃桿菌屬可引起養(yǎng)殖對(duì)象虹鱒幼魚患細(xì)菌性疾病，但由于在春秋兩季對(duì)養(yǎng)殖區(qū)施用生石灰進(jìn)行處理，未有大規(guī)模的虹鱒細(xì)菌性疾病爆發(fā)現(xiàn)象。有研究表明，施用生石灰后水體中的pH等理化指標(biāo)產(chǎn)生變化，一些致病菌受到抑制，水體中浮游細(xì)菌的多樣性和豐度提高，群落更加穩(wěn)定[3]。隸屬于藍(lán)細(xì)菌門的聚球藻屬，是劉家峽水庫(kù)浮游細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)種群，是一種固氮藍(lán)藻[16]，但在養(yǎng)殖區(qū)A5相對(duì)豐度減少。由表2可以看出，氮元素不是影響聚球藻屬生長(zhǎng)的主要影響因子，導(dǎo)致出現(xiàn)相對(duì)豐度減少的原因可能是由于養(yǎng)殖區(qū)域藻類生物量高[17]，導(dǎo)致水體透明度降低，影響聚球藻屬種類的生長(zhǎng)。厚壁菌門在養(yǎng)殖區(qū)的相對(duì)豐度增大的主要原因是與厚壁菌門是一類厭氧菌相關(guān)[18]，由于養(yǎng)殖區(qū)A5采樣點(diǎn)網(wǎng)箱框架設(shè)置較密，加上養(yǎng)殖密度大，周圍水體中的溶氧被大量消耗，給厚壁菌門的種類提供了一種缺氧環(huán)境。

變形菌門為劉家峽水庫(kù)最主要的浮游細(xì)菌，主要包括α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱。劉家峽水庫(kù)以α-變形菌綱中的一些種類為優(yōu)勢(shì)菌群，鞘氨醇單胞菌屬憑借自身的高代謝能力和多功能的生理特性，可以降解芳香族化合物[19]。在養(yǎng)殖區(qū)A5相對(duì)豐度增加，這可能由于該區(qū)域受到農(nóng)藥等有機(jī)物的污染，與放線菌門紅球菌屬在此區(qū)域相對(duì)豐度增高的原因相同。從非養(yǎng)殖區(qū)到養(yǎng)殖區(qū)，α-變形菌綱的Pelagibacteraceae-uncultured和Acetobacteraceae-uncultured兩個(gè)屬、β-變形菌綱的Limnohabitans屬以及γ-變形菌綱的Acinetobacter屬的相對(duì)豐度都降低，這與沈燕等[20]的研究結(jié)果水體中α-變性菌的豐度隨總磷濃度增加而增加不一致，可能是由于這幾種浮游菌類為光能型細(xì)菌，養(yǎng)殖區(qū)水體透明度降低，不利于生長(zhǎng)。Limnohabitans屬種類作為主要的淡水浮游細(xì)菌，TN對(duì)其生長(zhǎng)繁殖有重要的作用[21]，這與本研究得到的TN含量越高的水域Limnohabitans屬相對(duì)豐度越高的結(jié)果相一致。A5和A6養(yǎng)殖區(qū)的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的原因可能是由于網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)象不一致，A5養(yǎng)殖區(qū)除養(yǎng)殖虹鱒外，還有鱘魚和鯉魚等其他魚類，已有研究表明不同養(yǎng)殖對(duì)象的養(yǎng)殖水體中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不相同[22]。

3.3 浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與水環(huán)境因子的關(guān)系