吳維

武漢市第一醫(yī)院泌尿外科，武漢430022

腎細(xì)胞癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，患者早期癥狀不明顯。目前，臨床迫切希望通過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌診斷的新靶點(diǎn)和新基因[1]。HOTAIR為同源異形盒（homeobox，HOX）基因家族成員之一，且只存在于哺乳動(dòng)物的基因組中。HOX基因家族在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用，HOTAIR為被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)有反式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。近年來，相關(guān)研究顯示，很多惡性腫瘤患者體內(nèi)均存在HOTAIR異常表達(dá)，經(jīng)過對(duì)分子機(jī)制和生物學(xué)功能的探究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR對(duì)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展均有重要影響，腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后與HOTAIR的表達(dá)水平緊密相關(guān)[2]。EZH2為多梳基因（polycoml group gene，PcG）家族成員之一，而PcG蛋白為基因調(diào)控因子，可作用于一些基因的關(guān)鍵位點(diǎn)，進(jìn)而起到調(diào)控作用[3]。PcG蛋白可以分成PRC1、PRC2和PRC4等蛋白復(fù)合體，而PRC2主要由EZH2組成，可以對(duì)H3K27賴氨酸進(jìn)行介導(dǎo)行甲基化修飾，使下游基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制與基因沉默，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。本研究通過分析HOTAIRmRNA和EZH2mRNA在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，旨在為腎細(xì)胞癌的診療提供一些新的借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2017年5月于武漢市第一醫(yī)院行手術(shù)切除的經(jīng)病理學(xué)檢查確診的61例腎細(xì)胞癌患者的腎細(xì)胞癌組織存檔標(biāo)本。所有患者手術(shù)前均未接受放化療等治療，其中女性23例，男性38例；平均年齡（58.2±10.7）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；嫌色細(xì)胞癌4例，乳頭狀細(xì)胞癌19例，透明細(xì)胞癌38例。同時(shí)選取61例對(duì)應(yīng)的癌旁（距離病灶3 cm以上）正常腎組織標(biāo)本為對(duì)照。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol購(gòu)自美國(guó)SBS公司，無水乙醇購(gòu)自上海永大公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，亞硫酸氫鹽購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Foments公司，PCR引物購(gòu)自美國(guó)SBS公司；LXJ-6401型離心機(jī)購(gòu)自北京醫(yī)療儀器廠，ELGA PURELAB Ultra型實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)ELAG LabWater公司，H-1型微型混合器購(gòu)自上海彭氏公司，5%CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司，Mastercycler 5333型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，XD-10型超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京西城半導(dǎo)體設(shè)備廠，DYY-Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，F(xiàn)OTODYNE型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Image公司，DYY-Ⅲ31D型電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)腎細(xì)胞癌組織和癌旁正常腎組織中HOTAIRmRNA和EZH2mRNA的表達(dá)量。首先提取腎細(xì)胞癌組織和癌旁正常腎組織的總RNA，鑒定RNA的完整性，進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄，cDNA PCR擴(kuò)增，最后行瓊脂糖凝膠電泳[4]。mRNA相對(duì)表達(dá)量的判別：使用Gel Pro Analysizer檢測(cè)目的基因表達(dá)的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定3次，取其平均數(shù)值。mRNA的相對(duì)表達(dá)量=目的基因灰度值/GAPDH灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析；腎細(xì)胞癌組織中HOTAIRmRNA和EZH2mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用Pearson相關(guān)性分析。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中HOTAIR mRNA和EZH 2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

腎細(xì)胞癌組織中HOTAIRmRNA、EZH2mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁正常腎組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 不同組織中HOTAIR mRNA、EZH 2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 不同組織中HOTAIR mRNA、EZH 2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組織類型HOTAIR mRNA EZH2 mRNA

2.2 腎細(xì)胞癌組織中HOTAIR mRNA和EZH 2 mRNA表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系

不同臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況腎細(xì)胞癌患者的腎細(xì)胞癌組織中HOTAIRmRNA和EZH2mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表2）

2.3 腎細(xì)胞癌組織中HOTAIR mRNA與EZH 2 mRNA的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：腎細(xì)胞癌組織中，HOTAIRmRNA與EZH2mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.683，P﹤0.05）

表2 腎細(xì)胞癌組織中HOTAIR mRNA、EZH 2 mRNA表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，相關(guān)研究顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中會(huì)出現(xiàn)很多表觀遺傳學(xué)變化。而表觀遺傳學(xué)是指基因組序列不發(fā)生變化，但基因功能卻發(fā)生了改變，其中DNA的組蛋白修飾與甲基化較為常見，兩者均可以使基因的表達(dá)量下降，同時(shí)DNA序列不發(fā)生變化[5-7]。核小體是染色質(zhì)最基本的單位，由150 bp DNA與8個(gè)組蛋白組合而成，組蛋白球體外有DNA纏繞，若DNA對(duì)組蛋白的纏繞方式出現(xiàn)變化，其基因表達(dá)也隨之變化[8-9]。組蛋白能夠在相關(guān)酶的影響下出現(xiàn)不同的修飾過程，如乙?；?、甲基化等，稱作組蛋白修飾。EZH2為組蛋白H3K27甲基化酶，相關(guān)研究顯示，EZH2mRNA在前列腺癌中呈高表達(dá)，還有研究表明，EZH2不僅具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，還具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，對(duì)靶基因甲基化進(jìn)行調(diào)控，對(duì)基因沉默產(chǎn)生介導(dǎo)作用，可參與某些癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制[10-11]。EZH2有可能成為乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤診療等方面。HOTAIR能夠與PRC2復(fù)合體相結(jié)合，對(duì)HOXD位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄抑制進(jìn)行介導(dǎo)，而PCR2復(fù)合體的主要亞基為EZH2[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，不同臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況腎細(xì)胞癌患者的腎細(xì)胞癌組織中HOTAIRmRNA、EZH2mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。目前，腎細(xì)胞癌的主要治療方式為外科手術(shù)，放化療等輔助治療手段對(duì)腎細(xì)胞癌患者無明顯療效，而分子靶向治療為腎細(xì)胞癌患者提供了新的治療方向[14]。Kleer等[15]研究表明，EZH2有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，所以組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠?qū)HZ2的活性產(chǎn)生抑制，有可能會(huì)是治療腫瘤較為有效的藥物。lncRNA作為轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物分子，缺少深入探究，而HOTAIR則是腫瘤和其他疾病間有重要聯(lián)系的分子之一。相關(guān)研究顯示，PRC2復(fù)合體與HOTAIR結(jié)合以后，能經(jīng)過調(diào)控機(jī)理對(duì)860多個(gè)基因位點(diǎn)產(chǎn)生影響，對(duì)下游基因表達(dá)產(chǎn)生抑制。本研究結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌組織中HOTAIRmRNA與EZH2mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，當(dāng)HOTAIR基因的表達(dá)水平升高時(shí)，EZH2基因的表達(dá)水平也有升高趨勢(shì)。

綜上所述，HOTAIRmRNA和EZH2mRNA在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常腎組織；檢測(cè)腎細(xì)胞癌患者的HOTAIR、EZH2水平，對(duì)其腫瘤惡性程度的判斷有重要參考價(jià)值。