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        大鼠被動皮膚過敏試驗兩種佐劑選擇的探討

        2018-09-17 08:33:52張岱州劉宜輝
        食品與藥品 2018年4期
        關(guān)鍵詞:弗氏氫氧化鋁佐劑

        曹 沖,張岱州,劉宜輝,莊 婕

        (山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室,山東 濟南 250101)

        國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]規(guī)定,通常局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物需考察Ⅰ型過敏反應(yīng),如注射劑需進行被動皮膚過敏試驗(PCA),通常選大鼠進行試驗,劑量設(shè)計中應(yīng)設(shè)立陽性對照組和陰性對照組。陰性對照組應(yīng)給予同體積的溶媒,陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)。

        已有研究表明,大鼠PCA以卵白蛋白為致敏原時,需加入佐劑才能獲得良好的免疫效果[2-4]。佐劑自身并無免疫原性,不能引起免疫應(yīng)答,其主要作用是增強抗原的免疫原性,延長抗原在局部組組織中的停留時間,降低抗原降解速度。本試驗選用卵白蛋白為致敏原,比較兩種不同的佐劑類型──氫氧化鋁佐劑和弗氏完全佐劑,在不同致敏劑量、不同致敏途徑等可變因素下,對大鼠被動皮膚試驗結(jié)果的影響,以便得出敏感性較高、結(jié)果較穩(wěn)定的陽性對照。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        ACS-JJ型電子秤(梅特勒-托利多);AUW-120D型電子分析天平(日本島津公司)。

        1.2 試劑

        卵白蛋白(Sigma公司,批號:326A052);0.9 %氯化鈉注射液(青州堯王制藥公司,批號:3217040804);無水三氯化鋁(國藥集團,批號20150518);氫氧化鈉(國藥集團,批號:20141011);弗氏完全佐劑(Sigma公司,批號:SLBR3877V)。

        1.3 動物

        SD大鼠,SPF級,體重100~200 g,雌雄各半,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房,實驗動物使用許可證號:SYXK(魯)2014 0008,飼養(yǎng)室溫度為20~26 ℃,日溫差≤4 ℃,濕度為40 %~70 %。

        2 方法

        2.1 分組、致敏與致敏血清制備

        72只大鼠隨機分為12組,每組6只,抗血清制備階段每組2只,被動致敏階段每組4只,雌雄各半。以三氯化鋁溶液和氫氧化鈉溶液配成濃度約4 %的氫氧化鋁凝膠佐劑,與卵白蛋白1:1比例混勻,弗氏完全佐劑原液與卵白蛋白1:1比例混勻,各組大鼠于第1,3,5天分別給予受試物與佐劑混合物1 ml,共致敏3次。末次致敏后第10天,各組大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉,麻醉后腹主動脈取血,2000 r/min離心10 min,分離血清,將同組動物的血清混合后裝于EP管于當(dāng)日使用。

        2.2 被動致敏及激發(fā)

        將大鼠背部脫毛,脫毛區(qū)域約5 cm×6 cm。同時用0.9 %氯化鈉注射液稀釋各組制備好的致敏血清,稀釋度分別為原液、1:2、1:4、1:8。在脫毛不同區(qū)域的4個點按順時針或逆時針方向皮內(nèi)注射各稀釋度抗血清進行被動致敏,每個注射點0.1 ml,每側(cè)2個點,每點間隔約2~3 cm。皮內(nèi)注射抗血清約24 h后,各組尾靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原,給予0.5 ml抗原加0.5 ml 0.5 %伊文思藍混合后共1 ml的混合液[5]。

        2.3 判斷標(biāo)準

        抗原激發(fā)約30 min后,CO2麻醉處死動物,剪取背部皮膚,采用直接測量法測量皮膚內(nèi)側(cè)藍斑的長徑和短徑,不規(guī)則斑點的直徑為長徑與短徑的平均值。藍斑直徑在5 mm以上者判定為陽性[1,6],同時陰性對照組在該稀釋度下無藍斑。

        2.4 統(tǒng)計方法

        藍斑直徑采用平均值±標(biāo)準差(±s)表示,采用DAS 1.0軟件進行統(tǒng)計分析,P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 氫氧化鋁佐劑大鼠腹腔致敏途徑PCA結(jié)果

        結(jié)果見表2。由表2可見,以氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液為抗原,各注射點均未出現(xiàn)藍斑。以氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白為抗原,卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時,腹腔致敏途徑下,各組動物均出現(xiàn)藍斑,陽性反應(yīng)率為100 %,且原液、1:2、1:4、1:8注射點藍斑直徑均>5 mm,與陰性對照組比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。卵白蛋白劑量為20 mg/只時的藍斑直徑大于卵白蛋白劑量為10 mg/只時的藍斑直徑。

        表2 氫氧化鋁佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        表2 氫氧化鋁佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        注:與陰性對照組比較,*P<0.01

        氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 10 19.4±2.9*15.8±3.1*13.5±2.9*11.2±3.0*Ⅲ氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 20 24.9±2.4*18.1±1.7*15.9±1.5*14.0±1.3*Ⅸ 氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅰ

        3.2 氫氧化鋁佐劑大鼠皮下致敏途徑PCA結(jié)果

        結(jié)果見表3。由表3可見,以氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液為抗原,各注射點均未出現(xiàn)藍斑。以氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白作為抗原,卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時,皮下致敏途徑下,各組動物均出現(xiàn)藍斑,陽性反應(yīng)率為100 %,且原液、1:2、1:4、1:8注射點藍斑直徑均>5 mm,與陰性對照組比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠在卵白蛋白劑量為20 mg/只時的藍斑直徑大于大鼠在卵白蛋白劑量為10 mg/只時的藍斑直徑。

        表3 氫氧化鋁佐劑大鼠皮下致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        表3 氫氧化鋁佐劑大鼠皮下致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        注:與陰性對照組比較,*P<0.01

        組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅱ 氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 10 20.1±2.0* 14.8±2.6* 12.8±1.7* 11.0±1.3*Ⅳ 氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 20 23.4±2.0* 19.9±2.0* 17.5±2.6* 15.9±3.2*Ⅹ 氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0

        3.3 弗氏完全佐劑大鼠腹腔致敏途徑PCA結(jié)果

        結(jié)果見表4。由表4可見,以弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液為抗原,各注射點均未出現(xiàn)藍斑。以弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原,卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時,腹腔致敏途徑下,各組動物均出現(xiàn)藍斑,陽性反應(yīng)率為100 %,且原液、1:2、1:4、1:8注射點藍斑直徑均>5 mm,與陰性對照組比較,差異有高度意義。卵白蛋白劑量為20 mg/只時的藍斑直徑大于卵白蛋白劑量為10 mg/只時的藍斑直徑。

        表4 弗氏完全佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        表4 弗氏完全佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        注:與陰性對照組比較,*P<0.01

        組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅴ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 10 15.5±1.8* 12.2±0.8* 10.4±1.3* 8.6±1.6*Ⅶ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 20 18.4±2.9* 15.3±2.6* 12.1±1.6* 10.0±1.8*Ⅺ 弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0

        3.4 弗氏完全佐劑大鼠皮下致敏途徑PCA結(jié)果

        結(jié)果見表5。由表5可見,以弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液作為抗原,各注射點均未出現(xiàn)藍斑。以弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原,卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時,皮下致敏途徑下,各組動物均出現(xiàn)藍斑,陽性反應(yīng)率為100 %,且原液、1:2、1:4、1:8注射點藍斑直徑均>5 mm,與陰性對照組比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。卵白蛋白劑量為20 mg/只時的藍斑直徑大于卵白蛋白劑量為10 mg/只時的藍斑直徑。

        表5 弗氏完全佐劑大鼠皮下致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        表5 弗氏完全佐劑大鼠皮下致敏途徑藍斑直徑( ±s,n=4)

        注:與陰性對照組比較,*P<0.01

        組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅵ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 10 14.2±2.1* 11.0±1.7* 10.4±1.8* 7.9±0.8*Ⅷ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 20 18.9±2.8* 12.9±2.6* 10.6±1.4* 9.3±1.5*Ⅻ 弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0

        4 討論

        PCA是藥物非臨床安全性評價的重要部分,試驗操作簡單,結(jié)果直觀,已廣泛用于過敏性評價試驗中,有大量的背景數(shù)據(jù)。研究表明,不同品系的大鼠對藥物的免疫應(yīng)答敏感性不同,敏感性大小為SD大鼠>F344大鼠>W(wǎng)istar大鼠[7],因此本實驗選用SD大鼠進行試驗。王沖等[8]研究表明,在添加佐劑的情況下,可明顯增加卵白蛋白的過敏反應(yīng)敏感性,因此,大部分PCA試驗都使用佐劑,王金華等[4]等研究表明,卵白蛋白對大鼠的免疫原性要優(yōu)于牛血清白蛋白。傳統(tǒng)佐劑主要有礦物質(zhì)佐劑、油佐劑、微生物佐劑等[9],因此本實驗選用兩種類型的佐劑,礦物佐劑氫氧化鋁和油佐劑弗氏完全佐劑,抗原選用卵白蛋白,比較這兩種佐劑在卵白蛋白10 mg/只、20 mg/只劑量下,腹腔和皮下兩種途徑對大鼠PCA結(jié)果的影響。結(jié)果表明,以氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白和弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原,3次致敏動物,各組動物均出現(xiàn)藍斑,陽性反應(yīng)率為100 %,且藍斑直徑均大于5 mm,藍斑直徑大小與稀釋度呈負相關(guān),稀釋度越大,藍斑越小,即藍斑直徑大小原液>1:2>1:4>1:8。佐劑、卵白蛋白劑量、致敏途徑等因素不同,各注射點的藍斑直徑大小也存在差異,佐劑相同時,卵白蛋白劑量越大,藍斑直徑越大,且腹腔致敏途徑藍斑直徑稍大于皮下致敏途徑;致敏劑量、致敏途徑相同時,氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白作為抗原的藍斑直徑大于弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原的藍斑直徑。

        也有使用其他佐劑的研究。荊寶琴等[10]比較了3種佐劑引起SD大鼠PCA的反應(yīng)程度,過敏發(fā)生率和反應(yīng)嚴重程度依次為百白破聯(lián)合疫苗>百日咳菌液>氫氧化鋁。孫鴿等[11]研究表明,卵白蛋白+百白破疫苗作為致敏原,出現(xiàn)陽性結(jié)果的可重復(fù)性不高,且百白破聯(lián)合疫苗、百日咳菌液費用較貴,購買困難,且有效期短,不適宜大規(guī)模試驗。氫氧化鋁和弗氏完全佐劑則可獲得較穩(wěn)定的陽性結(jié)果,重復(fù)性高,但這兩種佐劑也都存在著不同優(yōu)缺點。弗氏完全佐劑現(xiàn)可從Sigma等公司購買商品化成品,質(zhì)量穩(wěn)定,使用方便,但其價格較高,較黏稠,不利于注射,氫氧化鋁佐劑價格便宜,購買方便,但其配制方法繁瑣,對pH值范圍要求較高。應(yīng)用這兩種佐劑時,無論是皮下還是腹腔致敏途徑,都會在注射部位引起較嚴重的局部反應(yīng),由于佐劑的吸收速度慢,導(dǎo)致皮下注射后易形成腫塊,腹腔途徑致敏時,大鼠出現(xiàn)腹腔內(nèi)腸黏膜炎性粘連[12],體重增長緩慢。在本試驗條件下,佐劑選用氫氧化鋁佐劑和弗氏完全佐劑,卵白蛋白使用劑量為10 mg/只時,便能得到較好的藍斑,因此,各實驗室可根據(jù)受試物特性選擇合適的佐劑,推薦大鼠被動皮膚過敏試驗中陽性物質(zhì)選擇卵白蛋白,同時,我們也期待新型佐劑的出現(xiàn)。

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