曹 沖，張岱州，劉宜輝，莊 婕

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]規(guī)定，通常局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物需考察Ⅰ型過敏反應(yīng)，如注射劑需進(jìn)行被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)（PCA），通常選大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，劑量設(shè)計(jì)中應(yīng)設(shè)立陽性對照組和陰性對照組。陰性對照組應(yīng)給予同體積的溶媒，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)。

已有研究表明，大鼠PCA以卵白蛋白為致敏原時(shí)，需加入佐劑才能獲得良好的免疫效果[2-4]。佐劑自身并無免疫原性，不能引起免疫應(yīng)答，其主要作用是增強(qiáng)抗原的免疫原性，延長抗原在局部組組織中的停留時(shí)間，降低抗原降解速度。本試驗(yàn)選用卵白蛋白為致敏原，比較兩種不同的佐劑類型──氫氧化鋁佐劑和弗氏完全佐劑，在不同致敏劑量、不同致敏途徑等可變因素下，對大鼠被動(dòng)皮膚試驗(yàn)結(jié)果的影響，以便得出敏感性較高、結(jié)果較穩(wěn)定的陽性對照。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACS-JJ型電子秤（梅特勒-托利多）；AUW-120D型電子分析天平（日本島津公司）。

1.2 試劑

卵白蛋白（Sigma公司，批號：326A052）；0.9 %氯化鈉注射液（青州堯王制藥公司，批號：3217040804）；無水三氯化鋁（國藥集團(tuán)，批號20150518）；氫氧化鈉（國藥集團(tuán)，批號：20141011）；弗氏完全佐劑（Sigma公司，批號：SLBR3877V）。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級，體重100～200 g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（魯）2014 0008，飼養(yǎng)室溫度為20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，濕度為40 %～70 %。

2 方法

2.1 分組、致敏與致敏血清制備

72只大鼠隨機(jī)分為12組，每組6只，抗血清制備階段每組2只，被動(dòng)致敏階段每組4只，雌雄各半。以三氯化鋁溶液和氫氧化鈉溶液配成濃度約4 %的氫氧化鋁凝膠佐劑，與卵白蛋白1:1比例混勻，弗氏完全佐劑原液與卵白蛋白1:1比例混勻，各組大鼠于第1，3，5天分別給予受試物與佐劑混合物1 ml，共致敏3次。末次致敏后第10天，各組大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，2000 r/min離心10 min，分離血清，將同組動(dòng)物的血清混合后裝于EP管于當(dāng)日使用。

2.2 被動(dòng)致敏及激發(fā)

將大鼠背部脫毛，脫毛區(qū)域約5 cm×6 cm。同時(shí)用0.9 %氯化鈉注射液稀釋各組制備好的致敏血清，稀釋度分別為原液、1:2、1:4、1:8。在脫毛不同區(qū)域的4個(gè)點(diǎn)按順時(shí)針或逆時(shí)針方向皮內(nèi)注射各稀釋度抗血清進(jìn)行被動(dòng)致敏，每個(gè)注射點(diǎn)0.1 ml，每側(cè)2個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔約2～3 cm。皮內(nèi)注射抗血清約24 h后，各組尾靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原，給予0.5 ml抗原加0.5 ml 0.5 %伊文思藍(lán)混合后共1 ml的混合液[5]。

2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

抗原激發(fā)約30 min后，CO2麻醉處死動(dòng)物，剪取背部皮膚，采用直接測量法測量皮膚內(nèi)側(cè)藍(lán)斑的長徑和短徑，不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長徑與短徑的平均值。藍(lán)斑直徑在5 mm以上者判定為陽性[1,6]，同時(shí)陰性對照組在該稀釋度下無藍(lán)斑。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

藍(lán)斑直徑采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用DAS 1.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 氫氧化鋁佐劑大鼠腹腔致敏途徑PCA結(jié)果

結(jié)果見表2。由表2可見，以氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液為抗原，各注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。以氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白為抗原，卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時(shí)，腹腔致敏途徑下，各組動(dòng)物均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑均＞5 mm，與陰性對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。卵白蛋白劑量為20 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑大于卵白蛋白劑量為10 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑。

表2 氫氧化鋁佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

表2 氫氧化鋁佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01

氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 10 19.4±2.9*15.8±3.1*13.5±2.9*11.2±3.0*Ⅲ氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 20 24.9±2.4*18.1±1.7*15.9±1.5*14.0±1.3*Ⅸ 氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍(lán)斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅰ

3.2 氫氧化鋁佐劑大鼠皮下致敏途徑PCA結(jié)果

結(jié)果見表3。由表3可見，以氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液為抗原，各注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。以氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白作為抗原，卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時(shí)，皮下致敏途徑下，各組動(dòng)物均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑均＞5 mm，與陰性對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠在卵白蛋白劑量為20 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑大于大鼠在卵白蛋白劑量為10 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑。

表3 氫氧化鋁佐劑大鼠皮下致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

表3 氫氧化鋁佐劑大鼠皮下致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01

組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍(lán)斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅱ 氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 10 20.1±2.0* 14.8±2.6* 12.8±1.7* 11.0±1.3*Ⅳ 氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白 20 23.4±2.0* 19.9±2.0* 17.5±2.6* 15.9±3.2*Ⅹ 氫氧化鋁佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0

3.3 弗氏完全佐劑大鼠腹腔致敏途徑PCA結(jié)果

結(jié)果見表4。由表4可見，以弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液為抗原，各注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。以弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原，卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時(shí)，腹腔致敏途徑下，各組動(dòng)物均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑均＞5 mm，與陰性對照組比較，差異有高度意義。卵白蛋白劑量為20 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑大于卵白蛋白劑量為10 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑。

表4 弗氏完全佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

表4 弗氏完全佐劑大鼠腹腔致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01

組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍(lán)斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅴ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 10 15.5±1.8* 12.2±0.8* 10.4±1.3* 8.6±1.6*Ⅶ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 20 18.4±2.9* 15.3±2.6* 12.1±1.6* 10.0±1.8*Ⅺ 弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0

3.4 弗氏完全佐劑大鼠皮下致敏途徑PCA結(jié)果

結(jié)果見表5。由表5可見，以弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液作為抗原，各注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。以弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原，卵白蛋白劑量為10 mg/只和20 mg/只時(shí)，皮下致敏途徑下，各組動(dòng)物均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑均＞5 mm，與陰性對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。卵白蛋白劑量為20 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑大于卵白蛋白劑量為10 mg/只時(shí)的藍(lán)斑直徑。

表5 弗氏完全佐劑大鼠皮下致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

表5 弗氏完全佐劑大鼠皮下致敏途徑藍(lán)斑直徑（ ±s，n=4）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01

組別 致敏原 卵白蛋白劑量/mg·只-1 藍(lán)斑直徑/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅵ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 10 14.2±2.1* 11.0±1.7* 10.4±1.8* 7.9±0.8*Ⅷ 弗氏完全佐劑+卵白蛋白 20 18.9±2.8* 12.9±2.6* 10.6±1.4* 9.3±1.5*Ⅻ 弗氏完全佐劑+0.9 %氯化鈉注射液 - 0 0 0 0

4 討論

PCA是藥物非臨床安全性評價(jià)的重要部分，試驗(yàn)操作簡單，結(jié)果直觀，已廣泛用于過敏性評價(jià)試驗(yàn)中，有大量的背景數(shù)據(jù)。研究表明，不同品系的大鼠對藥物的免疫應(yīng)答敏感性不同，敏感性大小為SD大鼠＞F344大鼠＞W(wǎng)istar大鼠[7]，因此本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。王沖等[8]研究表明，在添加佐劑的情況下，可明顯增加卵白蛋白的過敏反應(yīng)敏感性，因此，大部分PCA試驗(yàn)都使用佐劑，王金華等[4]等研究表明，卵白蛋白對大鼠的免疫原性要優(yōu)于牛血清白蛋白。傳統(tǒng)佐劑主要有礦物質(zhì)佐劑、油佐劑、微生物佐劑等[9]，因此本實(shí)驗(yàn)選用兩種類型的佐劑，礦物佐劑氫氧化鋁和油佐劑弗氏完全佐劑，抗原選用卵白蛋白，比較這兩種佐劑在卵白蛋白10 mg/只、20 mg/只劑量下，腹腔和皮下兩種途徑對大鼠PCA結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白和弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原，3次致敏動(dòng)物，各組動(dòng)物均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %，且藍(lán)斑直徑均大于5 mm，藍(lán)斑直徑大小與稀釋度呈負(fù)相關(guān)，稀釋度越大，藍(lán)斑越小，即藍(lán)斑直徑大小原液＞1:2＞1:4＞1:8。佐劑、卵白蛋白劑量、致敏途徑等因素不同，各注射點(diǎn)的藍(lán)斑直徑大小也存在差異，佐劑相同時(shí)，卵白蛋白劑量越大，藍(lán)斑直徑越大，且腹腔致敏途徑藍(lán)斑直徑稍大于皮下致敏途徑；致敏劑量、致敏途徑相同時(shí)，氫氧化鋁佐劑+卵白蛋白作為抗原的藍(lán)斑直徑大于弗氏完全佐劑+卵白蛋白作為抗原的藍(lán)斑直徑。

也有使用其他佐劑的研究。荊寶琴等[10]比較了3種佐劑引起SD大鼠PCA的反應(yīng)程度，過敏發(fā)生率和反應(yīng)嚴(yán)重程度依次為百白破聯(lián)合疫苗＞百日咳菌液＞氫氧化鋁。孫鴿等[11]研究表明，卵白蛋白+百白破疫苗作為致敏原，出現(xiàn)陽性結(jié)果的可重復(fù)性不高，且百白破聯(lián)合疫苗、百日咳菌液費(fèi)用較貴，購買困難，且有效期短，不適宜大規(guī)模試驗(yàn)。氫氧化鋁和弗氏完全佐劑則可獲得較穩(wěn)定的陽性結(jié)果，重復(fù)性高，但這兩種佐劑也都存在著不同優(yōu)缺點(diǎn)。弗氏完全佐劑現(xiàn)可從Sigma等公司購買商品化成品，質(zhì)量穩(wěn)定，使用方便，但其價(jià)格較高，較黏稠，不利于注射，氫氧化鋁佐劑價(jià)格便宜，購買方便，但其配制方法繁瑣，對pH值范圍要求較高。應(yīng)用這兩種佐劑時(shí)，無論是皮下還是腹腔致敏途徑，都會在注射部位引起較嚴(yán)重的局部反應(yīng)，由于佐劑的吸收速度慢，導(dǎo)致皮下注射后易形成腫塊，腹腔途徑致敏時(shí)，大鼠出現(xiàn)腹腔內(nèi)腸黏膜炎性粘連[12]，體重增長緩慢。在本試驗(yàn)條件下，佐劑選用氫氧化鋁佐劑和弗氏完全佐劑，卵白蛋白使用劑量為10 mg/只時(shí)，便能得到較好的藍(lán)斑，因此，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)受試物特性選擇合適的佐劑，推薦大鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)中陽性物質(zhì)選擇卵白蛋白，同時(shí)，我們也期待新型佐劑的出現(xiàn)。