房紹英，馬 河，侯重文，邵華榮，程艷玲

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

人參（Ginseng radix et rhizoma）為五加科多年生草本植物人參（Panax ginsengC. A. Mey.）的根，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥。人參多糖為人參的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)[1]、降血糖[2]、抗氧化[3]等多方面藥理作用。近年對(duì)人參多糖的研究熱點(diǎn)主要涉及分離純化、功能活性評(píng)價(jià)和作用機(jī)制探討[4-7]，藥動(dòng)學(xué)特征則未見(jiàn)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)僅有肌肉注射的人參多糖注射液上市，其他給藥途徑劑型有待開(kāi)發(fā)。本課題組前期采用生曬參提取獲得人參多糖，經(jīng)指紋圖譜鑒定其組成包括半乳糖醛酸、葡萄糖（S）、半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖；多糖重均分子量為2705，分子量分散系數(shù)1.69。本試驗(yàn)研究人參多糖靜脈注射、肌肉注射及口服3種給藥途徑在SD大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，計(jì)算肌注途徑和口服途徑的生物利用度，為后期人參多糖的臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；AUW-120D型電子分析天平（日本島津公司）；MS3型漩渦混懸器（德國(guó)IKA公司）；Thermo Sorvall 21R高速微量冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q Advantage A10超純水儀（德國(guó)默克公司）；ACS-JJ-Tiger電子計(jì)價(jià)秤（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

人參多糖（山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號(hào)：20160501，含量：94.27 %）；二水合磷酸二氫鈉（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20160106）；高氯酸（天津鑫源化工，批號(hào)：20150905，含量：70.0 %～72.0 %）；肝素鈉注射液（山東魯抗辰欣藥業(yè)公司，批號(hào)：1609286421）；水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級(jí)SD大鼠18只，雌雄各半，體重范圍230～260 g。由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2014 0007。飼養(yǎng)條件：SD大鼠于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，每籠5只。室溫19～26 ℃，濕度40 %～70 %，日溫差≤4 ℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2014 0008。

2 方法

2.1 動(dòng)物給藥與樣品采集

18只SD大鼠按體重隨機(jī)分成3組，每組6只，雌雄各半。禁食約12 h后，分別靜脈注射、肌肉注射、口服給予600 mg/kg人參多糖（以半乳糖醛酸計(jì)）。各組藥前采血，靜脈注射組于藥后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8 h，肌肉注射組于藥后0.25，0.5，1，2，4，6，8 h，口服組于灌胃給藥后0.5，1，2，4，6，8 h采血約0.5 ml，置于肝素鈉抗凝的離心管中經(jīng)4 ℃，12 000 r/min離心10 min，制備血漿，-20 ℃冷凍保存待測(cè)。

2.2 生物樣本測(cè)試

色譜柱：TSK-GEL G3000PWXL（7.8 mm×300 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.05 mol/L NaH2PO4，流速：0.6 ml/min，柱溫：35 ℃，檢測(cè)器：RID-20AT示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)池溫度：40 ℃，進(jìn)樣體積：20 μl。樣本處理：取血漿樣品100 μl置于1.5 ml離心管中，加入2 mol/L高氯酸溶液50 μl，渦旋2 min后11 000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)各組別人參多糖血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，利用DAS3.2.6藥動(dòng)學(xué)程序計(jì)算半衰期（t1/2）、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、表觀(guān)分布容積（Vd）、清除率（CL）、達(dá)峰濃度（Cmax）、平均滯留時(shí)間（MRT）、藥時(shí)曲線(xiàn)下面積（AUC0-t、AUC0-∞）等，并利用SPSS16.0對(duì)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與靜脈注射AUC0-t比較，計(jì)算肌肉注射和口服給藥途徑的絕對(duì)生物利用度。

3 結(jié)果

3.1 樣本測(cè)試方法考察

大鼠空白血漿色譜圖及實(shí)際測(cè)試血漿樣本色譜圖見(jiàn)圖1。由表1可見(jiàn)，在該分析條件下空白SD大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾人參多糖的測(cè)定。人參多糖的保留時(shí)間約11.8 min。

圖1 大鼠空白血漿色譜圖（A）及大鼠靜脈注射給予人參多糖注射液后血漿樣本色譜圖（B）

表1 靜注組、肌注組人參多糖藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

該方法在25～800 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性良好（Y=211.850X-4193.44，r2=0.9929），定量下限為25 mg/L（5平行樣本分析，RSD為3.84 %，RE為14.75 %）。在高、中、低3個(gè)濃度下，回收率分別為78.35 %±7.85 %，84.25 %±5.23 %，80.86 %±5.4 %，RSD小于10.02 %。在高、中、低3個(gè)濃度下考察3批次精密度與準(zhǔn)確度，人參多糖在每一濃度水平的批內(nèi)精密度（RSD）小于3.95 %，相對(duì)誤差（RE）為-13.39 %～5.00 %；批間精密度（RSD）小于8.24 %，相對(duì)誤差（RE）為-11.62 %～-2.30 %。在低、高2個(gè)濃度下，人參多糖血漿樣本3次凍融穩(wěn)定性RE分別為102.12 %±6.76 %，90 %±5.31 %，RSD小于6.62 %；-2 0 ℃凍存7 d穩(wěn)定性R E分別為9 8.4 6 %±9.67 %，105.46 %±4.92 %，RSD小于9.82 %。

3.2 人參多糖藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果

靜注組、肌注組SD大鼠分別靜脈注射、肌肉注射600 mg/kg人參多糖后，繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)圖（見(jiàn)圖2）；人參多糖主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1?？诜MSD大鼠灌胃給予600 mg/kg人參多糖后，血藥濃度均低于檢測(cè)限，未被檢出。靜注組與肌注組相比，t1/2z差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Vd、MRT和CL均低于肌注組（P＜0.01）；同時(shí)Cmax和AUC0-8h均明顯高于肌注組（P＜0.01）。根據(jù)肌注組及靜注組AUC0-8h平均值計(jì)算肌肉注射方式的絕對(duì)生物利用度為27.46 %。

圖2 靜注組（A）及肌注組（B）SD大鼠分別給予600 mg/kg人參多糖注射液后平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（n=6）

4 討論

藥動(dòng)學(xué)研究的前提是建立靈敏可靠的藥物分析方法。多糖類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)的特殊性及生物體內(nèi)大量?jī)?nèi)源性相似多糖的干擾，使該類(lèi)藥物的分析方法不同于傳統(tǒng)的化學(xué)藥品，檢測(cè)難度大、需解決的問(wèn)題多。目前用于多糖類(lèi)藥物的血藥濃度檢測(cè)方法主要有以下幾種：同位素標(biāo)記示蹤法[8]、生物檢定法[9]、色譜法[10]、熒光標(biāo)記[11]等。多糖類(lèi)藥物無(wú)紫外吸收基團(tuán)和熒光發(fā)射基團(tuán)，質(zhì)譜法也不適用于多糖的檢測(cè)。本研究采用分子排阻色譜法聯(lián)合示差折光檢測(cè)器，建立了有效可靠的分析方法，該方法樣本處理簡(jiǎn)單，重復(fù)性良好，準(zhǔn)確率高，為后續(xù)人參多糖藥動(dòng)學(xué)研究提供良好支持，但此分析方法仍有其應(yīng)用的局限性，由于示差折光檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度低，此方法的檢測(cè)限尚不能滿(mǎn)足口服途徑人參多糖在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制，血漿樣本存在大量?jī)?nèi)源性多糖，因此色譜分離容易存在內(nèi)源性干擾，樣本處理方法是影響色譜分離效果的重要因素。本試驗(yàn)分析方法建立時(shí)，對(duì)人參多糖血漿樣本的處理方法進(jìn)行了反復(fù)摸索，嘗試了不同濃度硫酸銨、乙酸鋅和高氯酸等多種蛋白質(zhì)沉淀方法，最終選擇2 mol/L高氯酸溶液渦旋沉淀去除蛋白質(zhì)，此方法人參多糖回收率在78 %以上，且色譜峰無(wú)內(nèi)源性干擾。

本試驗(yàn)初期參考人參多糖注射液臨床使用劑量，根據(jù)體表面積折算為大鼠給藥劑量，但給藥后血藥濃度均無(wú)法檢出，故提高多倍劑量并參考毒理試驗(yàn)劑量，最終擬定給藥劑量為600 mg/kg。該劑量下，靜脈注射組峰濃度可達(dá)4000 mg/L以上，而口服組峰濃度低于25 mg/L，不足靜注組的0.625 %，其原因可能由于人參多糖原型難吸收或在消化道內(nèi)被降解，使藥物濃度低于本方法的檢測(cè)限而無(wú)法檢出。比較肌肉注射組和靜脈注射組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，t1/2無(wú)明顯差異，靜注途徑Vd、MRT和CL低于肌注組，Cmax和AUC0-8h均明顯高于肌注組。結(jié)果顯示，肌肉注射人參多糖在體內(nèi)分布更廣，存留時(shí)間更長(zhǎng)，但肌肉注射的生物利用度較低，吸收進(jìn)入體循環(huán)的藥物相對(duì)量?jī)H為27.46 %，且本課題組相關(guān)藥效學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參多糖肌肉注射途徑存在明顯肌肉刺激性。本研究提示人參多糖開(kāi)發(fā)為靜脈注射劑型具有優(yōu)越性。