李 潔，劉敬民，李萬芳

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355；2. 山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東 濟南 250033；3. 山東協(xié)和學(xué)院，山東 濟南 250109）

北蟲草（Cordyceps militaris）在我國作為食藥 用真菌而廣泛應(yīng)用[1]，其研究與開發(fā)在近 30 年取得了迅猛發(fā)展，其藥用價值和保健功能已被人們廣泛接受，市場需求正不斷擴大[2]。

現(xiàn)代科學(xué)研究表明，北蟲草含有蟲草多糖、核苷類、蟲草酸和超氧化物歧化酶（SOD）等多種生物活性物質(zhì)[3]，具有增強細(xì)胞免疫、改善腎臟功能、抗腫瘤、延緩衰老等作用[4]。多項研究表明，這些作用均與免疫有關(guān)，通過影響機體免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，增強機體的免疫功能。目前鮮有關(guān)于北蟲草免疫活性部位篩選的文獻(xiàn)報道，尚不完全清楚山東北蟲草對機體免疫器官和巨噬細(xì)胞吞噬功能及抗體產(chǎn)生是否有影響。為篩選北蟲草子實體的免疫活性極性部位，本實驗采用系統(tǒng)溶劑法，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸餾水依次提取。采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能測定法、免疫器官重量法及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率測定法，研究山東北蟲草對小鼠免疫器官、巨噬細(xì)胞吞噬功能及抗體產(chǎn)生的影響，全面了解其作用機制，以期為科學(xué)開發(fā)和利用北蟲草資源提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超聲清洗儀（昆山市超聲儀器公司）；真空干燥箱（南京瑞奧）；電熱恒溫水溫箱（金壇杰瑞爾電器）；臺式水平離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；電子天平；解剖盤；手術(shù)剪；手術(shù)鑷；顯微鏡；計數(shù)器。

1.2 試劑

石油醚（60～90 ℃，天津廣成，批號：20160618）；乙酸乙酯（分析純，天津天大，批號：20150920）；正丁醇（天津廣成，批號：20151028）；植物血凝素（PHA，上海疾控生物科技，批號：20165802）；雞紅細(xì)胞（CRBC，自制）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，武漢全康）；凡士林；鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號：20161127）；Giemsa-Wright 染色液（上海遠(yuǎn)慕）；肝素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；蒸餾水（自制）。

1.3 材料

北蟲草子實體石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物（自制）。

1.4 實驗動物

1.4.1 實驗動物選擇 SPF級昆明種雌性小鼠160只，體重20±2 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供。

1.4.2 實驗動物飼養(yǎng)管理 所有小鼠同室分籠飼養(yǎng)，溫度（20±1）℃，濕度 40 %～50 %，光-暗周期12 h，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，實驗前飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。

2 方法

2.1 北蟲草子實體供試樣品制備

精密稱取上述各極性部位提取物適量，石油醚、乙酸乙酯提取物用0.5 % CMC-Na溶解；正丁醇、水提取物用蒸餾水溶解。

2.2 實驗動物處理

2.2.1 動物分組 將試驗動物按體重分為：石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水提取物組。每組按體重隨機分為：空白對照組，高、中、低劑量組，每組10只動物，每日1次連續(xù)灌胃30 d，空白對照組給予等體積蒸餾水?？辔端針?biāo)記。

2.2.2 免疫處理 試驗結(jié)束前3 d，各組腹腔注射生理鹽水稀釋過的PHA，劑量為0.3 ml/只。實驗當(dāng)天，每只小鼠腹腔注射1 % RBC生理鹽水溶液進(jìn)行免疫，劑量為1 ml/只。

2.3 不同極性提取物對小鼠免疫功能的影響實驗

2.3.2 免疫器官指數(shù)測定 小鼠飼喂4周后，稱重，頸椎脫臼處死，解剖動物，迅速取其免疫器官胸腺和脾臟，用濾紙吸去血漬，去除周圍組織和脂肪等，稱其濕重，計算免疫器官的指數(shù)。

2.3.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗 每只小鼠腹腔注射1 % CRBC 1 ml，頸椎脫臼處死，固定于手術(shù)臺上，消毒腹部皮膚，吸出腹腔洗液l ml，平均分滴于2片玻片上，37 ℃溫育30 min，用生理鹽水漂洗，以除去未貼片細(xì)胞，晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，4 %（v/v）Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，油鏡下記數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片記數(shù)100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

2.3.4 小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗 實驗前3 d，每只小鼠腹腔注射PHA 0.3 mg。3天后，小鼠斷尾取血至玻片一端，另取一載玻片推片，自然干燥后，Giemsa-Wright 染液染色，再用生理鹽水沖洗，用濾紙將標(biāo)本吸水干燥后，鏡檢。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞／（轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞+未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞）×100%

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS19.0軟件對實驗所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。試驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用組間t檢驗進(jìn)行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體重測定

實驗開始和結(jié)束時，分別將小鼠稱重。記錄樣品各組小鼠的體重與對照組比較。結(jié)果見表1。

表1 北蟲草不同極性部位對小鼠體重的影響/g（ ±s，n=10）

表1 北蟲草不同極性部位對小鼠體重的影響/g（ ±s，n=10）

組別 劑量 初始體重 終期體重 P石油醚提取物組對照組 18.6±0.5 35.1±1.3 -低劑量組 19.0±0.5 34.9±1.2 0.716中劑量組 21.1±0.5 35.4±1.7 0.823高劑量組 20.9±0.5 34.7±1.8 0.745乙酸乙酯提取物組對照組 19.1±0.5 35.7±1.4 -低劑量組 18.7±0.6 34.8±2.1 0.542中劑量組 21.0±0.6 35.1±2.2 0.697高劑量組 19.2±0.5 35.2±1.7 0.619正丁醇提取物組對照組 19.5±0.5 35.2±1.9 -低劑量組 19.4±0.6 35.1±2.3 0.463中劑量組 18.7±0.5 35.3±1.8 0.724高劑量組 19.3±0.6 35.3±1.5 0.497水提取物組對照組 18.6±0.5 34.9±1.6 -低劑量組 19.2±0.6 35.4±2.1 0.447中劑量組 20.8±0.6 35.3±1.4 0.835高劑量組 19.4±0.5 34.8±1.6 0.608

由表1可見，各樣品低、中、高劑量組小鼠終期體重與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2 免疫器官指數(shù)測定

各組小鼠稱重后處死，取出胸腺、脾臟，稱其濕重，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。結(jié)果見表2。

表2 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測定結(jié)果（±s，n=10）

表2 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測定結(jié)果（±s，n=10）

提取物組 對照組 1.671±0.052 - 2.497±0.046 -低劑量組 1.704±0.038 0.742 2.552±0.037 0.413石油醚中劑量組 1.753±0.044 0.626 2.581±0.043 0.315高劑量組 1.746±0.053 0.635 2.544±0.052 0.523乙酸乙酯提取物組 對照組 1.658±0.046 - 2.489±0.045 -低劑量組 1.713±0.037 0.583 2.553±0.043 0.533提取物組 對照組 1.667±0.055 - 2.491±0.042 -低劑量組 1.723±0.039 0.620 2.547±0.037 0.313中劑量組 1.750±0.043 0.737 2.578±0.034 0.611高劑量組 1.744±0.052 0.694 2.541±0.053 0.524正丁醇中劑量組 1.754±0.045 0.514 2.582±0.035 0.512高劑量組 1.747±0.053 0.538 2.554±0.049 0.520水提取物組對照組1.677±0.057-2.493±0.054-低劑量組1.720±0.038 0.518 2.553±0.032 0.347中劑量組 1.759±0.041 0.566 2.585±0.036 0.416高劑量組 1.748±0.054 0.575 2.549±0.053 0.463組別 劑量 胸腺指數(shù)/mg·g-1P脾臟指數(shù)/mg·g-1P

由表2可見，各樣品低、中、高劑量組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 北蟲草不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響

用不同劑量的北蟲草不同極性部位提取物灌胃小鼠30 d，油鏡下記錄各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，結(jié)果見表3。

表3 北蟲草不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

表3 北蟲草不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

組別 劑量組 吞噬率/% P 吞噬指數(shù)石油醚提取物組對照組 32.6±7.1 - 0.69±0.21低劑量組 33.6±11.4 0.315 0.75±0.33中劑量組 36.4±13.8 0.197 0.78±0.29高劑量組 40.3±12.7 0.104 0.84±0.31乙酸乙酯提取物組對照組 30.5±8.4 - 0.71±0.18低劑量組 31.6±9.7 0.542 0.78±0.22中劑量組 33.4±10.8 0.116 0.88±0.18高劑量組 35.4±10.3 0.105 0.84±0.20水提取物組 對照組 31.7±8.1 - 0.79±0.24低劑量組 48.6±11.6 ＜0.05 1.05±0.33中劑量組 59.4±13.8 ＜0.05 1.58±0.49高劑量組 39.3±10.7 0.079 0.83±0.30對照組 33.4±8.5 - 0.74±0.14低劑量組 37.6±11.7 0.542 0.95±0.23中劑量組 42.7±12.8 ＜0.05 1.05±0.27高劑量組 45.4±12.5 ＜0.05 1.16±0.32正丁醇提取物組

由表3可見，與對照組相比，北蟲草乙酸乙酯部位中劑量和高劑量對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率有增加作用（P＜0.05）；北蟲草水提取部位低劑量和中劑量對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和對照組相比有顯著性差異（P＜0.05），也有增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。

3.4 北蟲草不同極性部位對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

用不同劑量的北蟲草不同極性部位提取物灌胃小鼠30 d，油鏡下記錄各組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表4。

表4 北蟲草不同極性部位對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響（±s，n=10）

表4 北蟲草不同極性部位對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響（±s，n=10）

組別 劑量組 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率/% P石油醚提取物組對照組 37.6±2.1 -低劑量組 42.4±2.7 0.228中劑量組 48.3±2.8 ＜0.05高劑量組 65.4±2.5 ＜0.05乙酸乙酯提取物組對照組 35.9±3.6 -低劑量組 45.3±2.9 0.155中劑量組 55.1±2.6 ＜0.05高劑量組 67.2±3.7 ＜0.05正丁醇提取物組對照組 37.1±3.4 -低劑量組 41.5±3.8 0.518中劑量組 42.6±2.2 0.502高劑量組 45.5±2.3 0.473水提取物組對照組 36.4±2.8 -低劑量組 51.6±3.7 ＜0.05中劑量組 72.4±2.4 ＜0.05高劑量組 43.4±2.6 0.204

由表4可見，與對照組相比，北蟲草石油醚部位和乙酸乙酯部位中劑量和高劑量對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有增加作用（P＜0.05）；北蟲草水提取部位低劑量和中劑量對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）也有增加小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的作用。

4 討論

免疫是指機體通過免疫應(yīng)答排除抗原性異物，或被誘導(dǎo)呈免疫耐受狀態(tài)以維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定[5]。免疫系統(tǒng)具有免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視功能，可清除入侵病原生物及病毒感染細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。故此，若藥材提取成分可作用于免疫系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)和相應(yīng)組織、細(xì)胞及分子，即可有效提高機體免疫力，對抗感染及腫瘤等。

本研究表明，北蟲草乙酸乙酯部位和水提取部位具有增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的作用，也有增加小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的作用，從而說明對小鼠的適應(yīng)性免疫有促進(jìn)作用。這兩個部位活性成分研究最多的是蟲草多糖和蟲草素。蟲草多糖被認(rèn)為是當(dāng)前世界上最好的免疫促進(jìn)劑之一[6]。蟲草素是一種核苷類抗菌素，在抗癌抑瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌抗炎、降血糖、降血脂等方面的研究取得了突破性進(jìn)展[7]。亦有研究證實蟲草乙酸乙脂提取物的抗過敏機制與抑制磷酸化Syk，ERK，p38和JNK等蛋白表達(dá)相關(guān)[8]，而蟲草水提物能通過激活巨噬細(xì)胞NF-κB，增強NO的生成和促炎性細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2的表達(dá)，是一個良好的免疫增強劑[9]。這與本實驗的研究結(jié)果相吻合。

對山東北蟲草石油醚提取部位進(jìn)行GC-MS分析[10]：北蟲草石油醚提取部位中含有長鏈不飽和脂肪酸類，其中亞油酸相對含量高達(dá)63.28 %。文獻(xiàn)報道，許多不飽和脂肪酸除了能殺傷腫瘤細(xì)胞外，還能參與體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)[11]，本實驗證實了這一點，為進(jìn)一步研發(fā)北蟲草的臨床藥品、保健食品以及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

相比價格昂貴、資源貧乏的天然冬蟲夏草來說，北蟲草價廉易得、資源豐富，但是其生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)是什么，活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及作用機制值得進(jìn)一步研究。本試驗結(jié)果將對科學(xué)開發(fā)和利用北蟲草資源提供一定的實驗依據(jù)。