張曉薇

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

雞內(nèi)金為常用中藥，雉科動物家雞（Calus galus darnestieus Brisson）的干燥沙囊內(nèi)壁，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。含胃蛋白酶，淀粉酶，類角蛋白及谷氨酸，精氨酸，纈氨酸等18種氨基酸，黃色色素［2］。并含維生素B1，維生素B2，尼克酸，抗壞血酸及鋁、鈣、鐵、鎂、銅、鋅等無機(jī)元素。本品性平，味甘。具健胃消食、澀精止遺之功效［3］。此外還有學(xué)者報道雞內(nèi)金具有降脂、抗凝等作用［4］，從古至今一直是臨床的常用藥，價格比較便宜。由于雞內(nèi)金的臨床需求量較大，目前市場上雞內(nèi)金中摻偽、混淆現(xiàn)象較為嚴(yán)重。偽品是以腐竹、淀粉或豆制品類經(jīng)加工壓制后染色而成的薄片、細(xì)砂、食鹽等常見，這些偽品通過性狀可以簡單鑒別?；煜窞轼?、鵝、鴿子沙囊內(nèi)壁混作雞內(nèi)金用，雞內(nèi)金為不規(guī)則卷片，表面黃色、黃綠色或黃褐色，薄而半透明，具明顯的條狀皺紋，質(zhì)脆，易碎。鴨內(nèi)金性狀呈類圓形碟片狀，似雞內(nèi)金但較厚，呈黑綠色或紫黑色，稍有皺紋。造假者多采用硫磺熏白，或用漂白劑漂白，或用黃色顏料染色后混入雞內(nèi)金中［5］，二者混合起來通常性狀不易鑒別。如果使用這種產(chǎn)品會嚴(yán)重影響藥品質(zhì)量和臨床治療效果。另外雞的飼養(yǎng)方法很多，因產(chǎn)地、生長環(huán)境和取內(nèi)金的階段不同，其成分及含量相差很大。目前缺少雞內(nèi)金的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，市場上大部分是靠性狀來進(jìn)行鑒別，但鑒別的精確度比較差。曲萌等［6］通過DNA分子標(biāo)記方法進(jìn)行雞內(nèi)金的鑒別，但在一般實驗室難以實現(xiàn)。本實驗過SDS-PAGE，對其所含蛋白質(zhì)進(jìn)行分離分析，利用蛋白質(zhì)在等電點、分子量上的差異，達(dá)到簡單方便鑒別雞內(nèi)金的目的，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 實驗儀器 DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），DYCZ-24D型雙垂直電泳槽（北京市六一儀器廠），離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），電子天平，架盤天平（天津市天馬儀器廠），數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），微量移液器，培養(yǎng)皿（直徑120 mm），長頭的滴管，容量瓶，刻度吸管，吸耳球，燒杯。

1.1.2 實驗材料 母雞內(nèi)金，公雞內(nèi)金，小雞內(nèi)金，鴨內(nèi)金，鴿子內(nèi)金，均購置農(nóng)貿(mào)市場當(dāng)場宰割的動物。

1.1.3 實驗藥品 甘氨酸，丙烯酰胺（Acr），過硫酸銨（AP），β-巰基乙醇，三氯乙酸，N，N 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis），冰醋酸，三羥甲基氨基甲烷（Tris），甲醇，鹽酸，乙醇，四甲基乙二胺（TEMED，生化試劑），考馬斯亮藍(lán)R-250（染色劑），溴酚藍(lán)（指示劑）以上試劑均為分析純。十二烷基磺酸鈉（SDS）（sigma科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的配制

1.2.1.1 電泳緩沖液（pH 8.3） Tris 6.0 g，甘氨酸28.8 g，SDS 1 g加蒸餾水溶解，定容至1000 mL。置冰箱4℃保存，備用。用前稀釋5倍。

1.2.1.2 上樣緩沖液 1 M Tris-HCl（pH 6.8）2.0mL，β-巰基乙醇 1.0 mL，10%SDS 4.0 mL，甘油 2.0 mL，加蒸餾水至10 mL，置冰箱4℃保存，備用。

1.2.1.3 10%過硫酸銨 取0.1 g過硫酸銨加蒸餾水10 mL（用前配置）。

1.2.1.4 考馬斯亮藍(lán)染色液 0.25%（W/V），0.25 g考馬斯亮藍(lán)R-250，甲醇45 mL，冰醋酸 9.0 mL，蒸餾水45 mL，混勻使溶解。

1.2.1.5 脫色液 甲醇、冰醋酸、蒸餾水以3∶1∶6配制而成。

1.2.2 樣品的制備 取實驗材料1 g（預(yù)先研成粉末），加電泳緩沖液5 mL，超聲提取40 min，移至離心管中，按3 000 r/min離心30 min，靜置30 min，取上清液2 mL，加入等量上樣緩沖液，在100℃沸水中加熱5 min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合，加入0.05%溴酚藍(lán)示蹤劑100 μL，混勻備用。

1.2.3 凝膠的制備 參照文獻(xiàn)［7］配制12%分離膠及5%濃縮膠。用制膠模具制備。

1.2.4 加樣 用微量移液器分別吸取30 μL樣品提取液，緩緩注入樣品槽底部，樣品上加在入5 μL溴酚藍(lán)指示劑。

1.2.5 電泳 先進(jìn)行預(yù)電泳，不加樣品（I=30 mA，t=40 min）；預(yù)電泳結(jié)束后，加樣，開始時在濃縮膠先恒流30 mA，電泳約40 min。待樣品進(jìn)入分離膠后，改為恒流40 mA，電泳約5 h 45 min，當(dāng)溴酚藍(lán)示蹤劑前沿距硅膠框底邊0.5 cm時，停止電泳，關(guān)閉電源。然后拔掉楔形板，取下制膠扳。

1.2.6 染色、脫色 取出膠板，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，在室溫下染色4～6 h，用蒸餾水沖去凝膠表面附著染料，再用脫色液脫色，反復(fù)更換脫色液至譜帶背景清晰為止。

2 結(jié) 果

不同實驗材料電泳結(jié)果見圖1～圖3。圖1，1～4條為母雞，5～8條為公雞。圖2，1～4條為母雞，5～8 條為小雞。圖 3，1～3 雞內(nèi)金，4～6 為鴨內(nèi)金，7～9為鴿子內(nèi)金。

圖1 不同性別的雞內(nèi)金SDS-PAGE圖譜

圖2 不同生長階段的雞內(nèi)金SDS-PAGE圖譜

圖3 雞內(nèi)金，鴨內(nèi)金和鴿子內(nèi)金SDS-PAGE圖譜

3 討論

3.1 不同性別雞內(nèi)金的電泳圖譜比較

雞內(nèi)金的蛋白含量多少直接決定了該味藥的品質(zhì)。由圖1可見不同性別的雞內(nèi)金蛋白質(zhì)SDSPAGE電泳譜帶有很大的相似性，但也存在一定的差異。A區(qū)由上至下可以看到母雞內(nèi)金較公雞內(nèi)金多一條較淺的譜帶，且母雞內(nèi)金顏色也較公雞內(nèi)金深。B區(qū)從譜帶的數(shù)目，顏色深淺，母雞和公雞都大致相同。C區(qū)大體相同，只是母雞的蛋白質(zhì)含量略高一點。

3.2 不同生長階段的雞內(nèi)金電泳圖譜比較

由圖2可見，母雞和小雞內(nèi)金的蛋白譜帶有很大的區(qū)別。A區(qū)母雞還有較淺的譜帶，而小雞幾乎沒有；B區(qū)母雞內(nèi)金有比較清晰的譜帶，而小雞的卻不太明顯。說明該區(qū)母雞蛋白含量明顯比小雞多。C區(qū)母雞內(nèi)金的譜帶數(shù)目也明顯比小雞的多，且譜帶也比小雞的清晰。雞內(nèi)金具健胃消食、澀精止遺之功效。未達(dá)到取內(nèi)金生長階段的雞內(nèi)金，由于缺少某些有效成分，其臨床功效有很大差異。

3.3 雞內(nèi)金、鴨內(nèi)金、鴿子內(nèi)金的比較

由圖3觀察雞內(nèi)金、鴨內(nèi)金及鴿子內(nèi)金的譜帶都有一定的差異。A區(qū)雞內(nèi)金的譜帶最多，也最清楚。而鴨內(nèi)金的有些譜帶缺少，鴿子內(nèi)金的譜帶位置與雞內(nèi)金比有一些差別。B區(qū)三者譜帶位置一致，大約都有三條譜帶，但鴿子內(nèi)金的譜帶分離的更清楚，雞內(nèi)金譜帶清楚的只有二條。C區(qū)三者有明顯的區(qū)別，其中雞內(nèi)金的最清楚。

通過以上實驗可以看出母雞和公雞內(nèi)金蛋白區(qū)別不大，作為一味中藥，公雞和母雞雞內(nèi)金應(yīng)該都能入藥，對臨床藥效影響不大；不同生長時期雞內(nèi)金、蛋白質(zhì)圖譜之間存在較大的差異。說明不同階段的雞內(nèi)金有效成分相差較大，臨床應(yīng)該用成熟的雞內(nèi)金入藥。這也為目前臨床上使用雞內(nèi)金提供了一項可行的鑒定依據(jù)。不同物種雞內(nèi)金、鴨內(nèi)金及鴿子內(nèi)金所得SDS-PAGE圖譜存在明顯不同，所以臨床上不應(yīng)混用，以免影響臨床療效。雞內(nèi)金與混淆品外觀極其相似，購買時易混淆，沈琴華［8］用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行過分析，但手段略顯落后，使用SDS-PAGE進(jìn)行分析能更高效清楚的表現(xiàn)各種物質(zhì)的蛋白質(zhì)差別，為雞內(nèi)金的鑒別提供可行的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。

陸維承等［9］報道雞內(nèi)金水煮比傳統(tǒng)工藝砂炒的淀粉酶活力要強(qiáng)，而本實驗對樣品處理進(jìn)行了方法學(xué)比較。實驗證明超聲處理，圖譜條帶更為清晰，所得蛋白含量比傳統(tǒng)水煮高，因為超聲處理后，液體呈糊狀，極大的促進(jìn)了雞內(nèi)金與酶的接觸，加速了水解，促進(jìn)酶解速度，提取效率明顯增高，為金內(nèi)經(jīng)的提取工藝提出了新的方法。