王一帆，李小峰，羅道明，蔡金宏，楊 淵

1.云南省文山州中醫(yī)醫(yī)院(文山 663000)，2.廣西骨傷醫(yī)院骨四科(南寧 530001)， 3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬瑯東醫(yī)院骨科(南寧 530001)

主題詞 骨關(guān)節(jié)炎,膝/治療 富血小板血漿/治療應(yīng)用 注射，關(guān)節(jié)內(nèi)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)腫痛、活動障礙為主要臨床表現(xiàn),以膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨退行性變及周圍組織無菌性炎癥為主要病理變化的骨科常見疾病，其癥狀多表現(xiàn)為膝紅腫痛、上下樓梯痛、坐起立行時膝部酸痛不適。本病好發(fā)于中老年人群，并且隨著現(xiàn)今社會人口老齡化及肥胖人群的增加，患病人數(shù)日益攀升，是嚴(yán)重危及中老年人健康的慢性進行性疾病之一[1]，也是老年人出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙的主要原因[2-3]。現(xiàn)今治療方法多樣，有較多學(xué)者針對“生長因子+支架材料”思路選擇富血小板血漿(Platelet rich plasma，PRP)治療KOA在臨床取得了積極的治療效果，但目前尚未有針對適宜血小板濃度PRP治療KOA的報道。本研究通過對在廣西骨傷醫(yī)院自體療法中心接受PRP治療的KOA患者進行前瞻性臨床隨機對照研究，分析不同血小板濃度PRP對KOA患者的療效，通過臨床觀察評分在一定程度上探索出最佳富血小板血漿使用濃度范圍。

資料和方法

1 一般資料 選擇2015年1月至2016年10月在廣西骨傷醫(yī)院自體療法中心就診并符合納入標(biāo)準(zhǔn)病例64例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》(2007年版)[4]膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn),且影像學(xué)分級符合Kellgren-Lawrenc分級[3]中Ⅰ級-Ⅲ級；排除標(biāo)準(zhǔn)：其他相關(guān)疾病波及膝關(guān)節(jié)或患有嚴(yán)重的心腦血管疾病等研究影響結(jié)果者。將納入患者按隨機數(shù)字表法先隨機分為A、B、C、D組。終末隨訪時B、C組分別失訪2、3例患者,均未能聯(lián)系到患者，予剔除。最終納入病例59例,所有患者均完成9個月隨訪，各組患者在性別、年齡、病程、Kellgren-Lawrence分級等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，見表1。

表1 各組患者年齡、性別、病程及Kellgren-Lawrwncn比較

2 自體富血小板血漿制備方法 由患者肘正中靜脈抽取患者靜脈血20ml后置入高速離心機(美國sigma公司 D37520)，參考Aghaloo法[5-6]二次離心，第一次以離心力275×g離心10min后于超凈工作臺內(nèi)用1ml注射器配7號注射器針頭抽取上清、交界層、交界層下少許紅細胞，移入無菌離心管，第二次以離心力870×g離心15min后用1ml注射器配7號注射器針頭去除上層貧血小板血漿(必要時去除底部少量紅細胞層)后得到2.2ml富血小板血漿。將0.2ml富血小板血漿用0.9%氯化鈉注射液稀釋至2ml后送檢驗科急查富血小板血漿中血小板濃度，根據(jù)各組濃度將所獲得的富血小板血漿以0.9%氯化鈉注射液(國藥準(zhǔn)字 H11020510)稀釋至目標(biāo)范圍后留取2ml加入10%氯化鈣(國藥準(zhǔn)字 H51023149)0.2ml激活富血小板血漿中的血小板(各組患者富血小板血漿的制備均由同一組有經(jīng)驗的醫(yī)師嚴(yán)格按照無菌操作要求完成)。

稀釋PRP需加入0.9%氯化鈉注射液計算方法：

(獲得PRP血小板濃度×2ml)/(2ml+需要加氯化鈉體積)=所需PRP濃度范圍中間值

3 治療方案 各組均口服依托考昔片(國藥準(zhǔn)字J20130133)，作為基礎(chǔ)治療(30mg/次，1次/d，持續(xù)2周)。所有患者均根據(jù)分組分別接受不同濃度的PRP治療。A組富血小板血漿中血小板濃度(900～1200)×109/L，B組富血小板血漿中血小板濃度(1200～1500)×109/L，C組富血小板血漿中血小板濃度(1500～1800)×109/L，D組富血小板血漿中血小板濃度(1800～2100)×109/L。每7天重復(fù)一次膝關(guān)節(jié)注射治療，持續(xù)6周。所有注射前不應(yīng)用局部麻醉藥(利多卡因或其他)，注射后被動屈伸活動患者膝關(guān)節(jié)3～5次，建議患者治療后休息2d，1周內(nèi)避免過度負重行走及劇烈活動。告知患者治療后出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)臨時的酸脹、疼痛等反應(yīng)屬于正常，但如果持續(xù)的紅腫熱痛等情況，需及時返院復(fù)診。

4 觀測指標(biāo) ①治療前及治療后3、6、9個月時回訪病人，按照美國西部Ontario和Mc aster大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分(WOMAC骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分) 、國際膝關(guān)節(jié)文獻委員會膝關(guān)節(jié)評估表(IKDC評分)、VAS視覺疼痛評分評定療效[4,7]。②觀察患者不良反應(yīng)出現(xiàn)情況。

5 盲 法 因治療者無法設(shè)盲，故僅對受試對象、結(jié)局評估者及數(shù)據(jù)統(tǒng)計者設(shè)盲。試驗過程中注意對受試對象及結(jié)局評估者采取隱藏盲法。試驗結(jié)束后進行揭盲,由統(tǒng)計分析人員完成數(shù)據(jù)錄入以及統(tǒng)計分析報告。

結(jié) 果

1 治療前后三組VAS、IKDC、WOMAC評分比較 三組治療后的VAS、IKDC、WOMAC評分比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(VAS評分：F= 3.982,P=0.012；IKDC評分：F=3.076，P=0.035；WOMAC評分：F= 4.944,P=0.004；),其中，治療后在不同隨訪時間點C組VAS評分改善均優(yōu)于A組 (P<0.01)，治療后3個月時優(yōu)于B組 (P<0.05)，D組治療后第6、9個月隨訪，評分優(yōu)于A組 (P<0.05)；C組治療后所有隨訪時間點WOMAC評分改善均優(yōu)于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，A、B、D組在治療后各隨訪時間點WOMAC評分無統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0.05)；C組治療后所有隨訪IKDC評分改善均優(yōu)于A組及D組,治療后第6個月。第9個月時隨訪IKDC評分改善均優(yōu)于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，D組治療后第3個月隨訪，較B、C組評分差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。三組各項評分均有隨時間變化的趨勢(VAS評分：F=55.925，P<0.001；IKDC評分：F=30.667，P<0.001；WOMAC評分：F=34.763，P<0.001)，B、C、D組患者治療后所有隨訪時間點評分均優(yōu)于治療前 (P<0.05)，A組患者治療終末隨訪時VAS評分、IKDC評分與治療前無統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0.05)，同時VAS、IKDC、WOMAC評分的分組及時間均存在交互效應(yīng)(VAS評分：F交互=2.234，P=0.048.001；IKDC評分：F=2.882，P=0.010；WOMAC評分：F=2.934，P=0.011)，見表2～4。

表2 各組中治療前后各組VAS評分

注：同A組相比，▲P<0.05；同B組相比，△P<0.05；同C組相比，#P<0.05；同治療前比，&P<0.05

表3 各組中治療前后各組IKDC評分

注：同A組相比，▲P<0.05；同B組相比，△P<0.05；同C組相比，#P<0.05；同治療前比，&P<0.05

表4 各組中治療前后各組IKDC評分

注：同A組相比，▲P<0.05；同B組相比，△P<0.05；同C組相比，#P<0.05；同治療前比，&P<0.05

2 兩組患者治療后出現(xiàn)不良情況 所有納入研究患者關(guān)節(jié)內(nèi)、注射位置均未出現(xiàn)感染等嚴(yán)重并發(fā)癥。共計59例膝關(guān)節(jié)354次膝關(guān)節(jié)注射中有38次出現(xiàn)短暫的膝關(guān)節(jié)酸脹痛，短期局部皮膚溫度上升等不適，但所有患者予膝關(guān)節(jié)冰敷及休息等處理后癥狀均在3d(平均1.81±0.79d)內(nèi)消失，不良反應(yīng)發(fā)生率為10.73%(38/354)。

討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA) 是以受累關(guān)節(jié)軟骨持續(xù)進行性變性及破壞，同時伴隨關(guān)節(jié)周圍組織的無菌性炎癥引起關(guān)節(jié)周圍組織病理性重塑為主要特征的骨科常見退行性疾病。年齡增大會伴隨軟骨細胞能量代謝異常，及軟骨日益磨損而引起關(guān)節(jié)軟骨破壞[8]，導(dǎo)致本病高發(fā)老年中老年人群，是我國老年人致畸致殘的重要因素。且目前本病的發(fā)病率正隨著社會的老齡化和肥胖人口的增多而日益攀升，在美國的一項調(diào)查結(jié)果顯示本病發(fā)病率僅次于心血管疾病[9]。因其發(fā)病率高，晚期致殘風(fēng)險大而與癌癥、心血管疾病一起被世界衛(wèi)生組織列為人類健康三大“殺手”。其高發(fā)病率、長期的治療費用高及療效欠佳已經(jīng)成為急需解決的難題。

目前對早期根治本病尚無良策，僅能延緩病情的發(fā)展[10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對膝骨關(guān)節(jié)炎的治療思路主要為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨(內(nèi)外源性修復(fù)及基因修復(fù)等)和抗炎對癥處理。但常用的口服藥和關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物因療效有限或副作用等并沒有取得足夠滿意的效果[11-13]。手術(shù)治療亦有一定的療效，但因創(chuàng)傷等因素在臨床使用中未必能夠廣泛推廣且適應(yīng)癥有待進一步探討[14-16]；直到近年再生醫(yī)學(xué)的興起且有人提出使用“生長因子+支架材料”以組織工程化軟骨的方式促進軟骨修復(fù)，是促進KOA病人損傷軟骨修復(fù)的新手段[17-18]。在課題組前期的研究證實了PRP治療KOA的安全有效性[19]。且研究認(rèn)為PRP對于KOA的治療作用機制之一就是通過血小板釋放的生長因子促進軟骨再生修復(fù)以及關(guān)節(jié)周圍炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。但通過對文獻的研究發(fā)現(xiàn)對于臨床使用PRP中血小板的適宜濃度無可靠的臨床研究證據(jù)。

本研究通過對臨床使用PRP治療KOA的臨床療效進行了進一步的隨機臨床對照研究，發(fā)現(xiàn)PRP對于KOA患者VAS評分改善以C組最明顯，在不同隨訪時間均優(yōu)于A組，治療后3個月優(yōu)于B組，說明PRP能夠有效減輕患者疼痛癥狀，且以C組效果明顯；對于WOMAC評分C組在治療后不同隨訪時間均以C組為優(yōu)，另對于IKDC評分A、B、D組治療后組間比較評分無差異，但C組均優(yōu)于A、D組，治療后6個月開始優(yōu)于B組，說明在緩解疼痛基礎(chǔ)上，PRP能夠有效改善KOA患者關(guān)節(jié)功能，且不同濃度呈現(xiàn)療效區(qū)別，呈一定劑量依賴表現(xiàn)。另外隨著時間推移，各評分均提示出現(xiàn)療效降低，但C組相對降低緩慢，A組甚至在終末隨訪與治療前比較無明顯差異。

PRP是將患者靜脈血經(jīng)離心得到的高血小板濃度制品，因其來源于患者自身，取材方便，無毒，無免疫原性反應(yīng)，制備簡便等優(yōu)點在組織損傷修復(fù)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用?；A(chǔ)研究早在1998年就已經(jīng)證實其含有大量生長因子并逐步運用于臨床[20]，這些生長因子可以促進成骨(軟骨)細胞的增殖，抑制破骨細胞的功能，并能誘導(dǎo)軟骨和骨基質(zhì)的合成，促進軟組織愈合。PRP進入關(guān)節(jié)腔后經(jīng)激活劑激活，通過血小板的脫顆粒作用，促使α顆粒中的大量生長因子緩慢釋放，促使蛋白聚糖、二型膠原、SOX-9等特異性基質(zhì)的分泌而參與到軟骨修復(fù)過程中來[21-23]，并且可以通過一系列的細胞因子機制將起源于周圍正常軟骨的多形軟骨細胞激活修復(fù)損傷軟骨[24]；其它多能干細胞也能被激活并參與軟骨的修復(fù)。理論上PRP中血小板濃度越高，獲得的生長因子濃度越高，對于軟骨修復(fù)再生越有積極作用。有研究對比使用不同血小板濃度的PRP體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性發(fā)現(xiàn)，不同濃度的PRP均能在一定程度上促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖分化，并且隨著加入PRP的濃度增加，骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力逐漸加強[25]；杜剛等人通過PRP與骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合物對兔軟骨缺損模型進行修復(fù)，發(fā)現(xiàn)兔軟骨缺損修復(fù)的程度和使用的PRP濃度呈一定的線性關(guān)系[26]；同樣，也有學(xué)者通過體外研究發(fā)現(xiàn)PRP對成骨細胞的促增殖呈劑量依賴性，最佳血小板濃度為(800～1000)×109/L[27]；有學(xué)者在軟骨細胞的培養(yǎng)基中加入不同比例的PRP，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞增殖分化的能力及細胞表型的保持與添加PRP的劑量呈相關(guān)表現(xiàn)[28-30]。因此提高PRP中的血小板衍化生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等促進軟骨細胞自身分裂增殖并長大后實現(xiàn)的軟骨內(nèi)修復(fù)，并刺激軟骨膜下或者軟骨下骨的細胞生長分化形成，完成軟骨外修復(fù)。以達到修復(fù)KOA患者關(guān)節(jié)軟骨，改善關(guān)節(jié)功能是治療重點，但本研究結(jié)果與上述結(jié)論存在一定分歧，結(jié)果顯示并非一味的提高血小板濃度以獲得高濃度的生長因子就能持續(xù)增加PRP的療效，這與現(xiàn)有的其他部分研究報道有一定相似性，Marx等[20]認(rèn)為不低于5倍血小板濃度的富血小板血漿對于關(guān)節(jié)軟骨才具有積極作用，但是報道認(rèn)為增加血小板倍率并不能絕對增加軟骨增殖能力，有研究顯示PRP對人肌腱細胞培養(yǎng)中刺激其增殖、遷移及膠原合成的最適宜濃度為(500～1000)×109/L，當(dāng)血小板濃度為2000、3000×109/L時增殖能力明顯減弱[31]。人體的PRP有效濃度界限為(503～1729)×109/L，當(dāng)血小板濃度超過1800×109/L時其促進組織再生修復(fù)的能力明顯減弱，甚至表現(xiàn)出抑制效果[32]。分析其原因有學(xué)者認(rèn)為局部血小板濃度過高，意味著較多的細胞毒素將會影響生長因子的活性[33]，另外PRP中不止含有促軟骨再生及抗炎生長因子，部分細胞因子對軟骨細胞再生及炎癥修復(fù)呈負面影響，如轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)雖然能促進軟骨修復(fù)，但其含量過多將會抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)合成，從而減少促進軟骨細胞分化能力[34]。因此我們可以認(rèn)為PRP治療KOA的臨床使用中有一個最佳血小板應(yīng)用濃度范圍，低于這個范圍可能達不到最佳療效，而濃度過高可能會起到抑制軟骨修復(fù)的效果。

另外膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)展過程不止涉及到軟骨的破壞，還有一系列炎癥因子介導(dǎo)的關(guān)節(jié)周圍軟組織重塑[35]。而膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的研究也認(rèn)為PRP之所以能夠在治療KOA中起到積極的作用主要是減少了白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、前列腺素2(Prostaglandin 2，PGE 2)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等可誘發(fā)本病且導(dǎo)致機體疼痛的主要因子[36]，從而發(fā)揮了抗炎作用[37]。另外有學(xué)者根據(jù)獲得的PRP中白細胞含量提出了富白細胞富血小板血漿和貧白細胞富血小板血漿的分類[38]，而根據(jù)其定義，本研究中使用的PRP為富白細胞富血小板血漿，含有較高濃度的白細胞。在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP使得較多白細胞進入關(guān)節(jié)腔，可誘導(dǎo)多種炎癥調(diào)節(jié)因子在損傷部位聚集，直接作用在關(guān)節(jié)腔內(nèi)以調(diào)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)，從而達到抗炎并修復(fù)組織的作用[39-40],但本研究中使用的高濃度的PRP中白細胞的濃度隨之上升，當(dāng)大量的白細胞進入關(guān)節(jié)腔后必然釋放更多的IL-1、IL-6、PGE2及TNF-α等，所介導(dǎo)的無菌性炎癥反應(yīng)程度KOA病變發(fā)展程度密切相關(guān)[41]，并可能導(dǎo)致新的軟骨損傷，從而對抗了生長因子對軟骨的修復(fù)作用。另外較白細胞濃度的上升將導(dǎo)致局部IL-1、IL-6、PGE2及TNF-α等炎癥因子的濃度升高，引起患者治療后出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀出現(xiàn)反跳[19]，這也可能示本研究中PRP治療KOA的療效存在一個“頂濃度”而非絕對劑量依賴的原因之一。

本研究結(jié)果分析，不同血小板濃度的富血小板血漿對膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的療效在一定程度上呈劑量依賴，最適宜濃度可能為(1500～1800)×109/L。部分患者出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)紅腫疼痛等反應(yīng)，與注射的富血小板血漿中白細胞及紅細胞濃度較高有關(guān)，通過冰敷、休息等處理后均短期明顯緩解，且未見治療后出現(xiàn)感染、血栓等嚴(yán)重并發(fā)癥，綜上所述，自體富血小板血漿關(guān)節(jié)腔注射治療膝骨性關(guān)節(jié)炎安全有效。其臨床使用最適宜血小板濃度為(1500～1800)×109/L。但貧白細胞富血小板血漿與富白細胞富血小板血漿對于臨床療效是否存在差異及針對PRP中如何提高“積極細胞因子”濃度，減少“消極細胞因子”干擾等問題有待深入探討。