李煒峰，占 龍，李張生，李小峰，楊 淵

1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)(南寧 530001)，2．廣西骨傷醫(yī)院(南寧 530012)，3．廣西醫(yī)科大學(xué)附屬瑯東醫(yī)院(南寧 530012)

主題詞 骨碎補 富血小板血漿/治療應(yīng)用 前交叉韌帶 骨折愈合 生物力學(xué)現(xiàn)象 兔

前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)重要的靜力和動力性穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，由縱行排列的膠原纖維束構(gòu)成，并在較大的功能束內(nèi)形成緊密的簇狀結(jié)構(gòu)。ACL損傷后難以自愈，易常造成嚴(yán)重膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，繼發(fā)半月板損傷和骨關(guān)節(jié)炎。目前多建議行手術(shù)重建ACL[1]。重建后腱骨愈合情況是手術(shù)成功的關(guān)鍵因素，因此，如何促進重建術(shù)后腱骨愈合也成為當(dāng)前研究的熱點。骨碎補是骨傷科常用的藥物，中醫(yī)認(rèn)為其具有補益肝腎，強筋接骨，通絡(luò)止痛的功效，可改善骨代謝，因此常用于骨折，骨質(zhì)疏松等疾病的治療，效果確切[2-3]。富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)是自體靜脈血經(jīng)離心后獲得的含多種生長因子的血液制品，這些因子在肌腱愈合中可促進細(xì)胞增殖、膠原合成、炎性趨化[4]。本研究在兔行ACL重建術(shù)后在骨髓道中注入PRP并口服骨碎補，同時與對富血小板血漿組、骨碎補組、空白組相比，術(shù)后12周取材行Micro-CT掃描及三維重建，測量骨隧道內(nèi)口擴大寬度及腱骨界面處骨密度(Bone mineral density，BMD)并行生物力學(xué)測定，評估各組對前交叉初帶重建后腱骨愈合及生物力學(xué)的影響。

材料和方法

1 實驗動物 本研究共使用 72 只骨骼成熟的新西蘭白兔，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號 ：SYXK(桂)：2014-0003，雌雄不限，6月齡，體質(zhì)量約 3 kg，根據(jù)國際實驗動物科學(xué)理事會關(guān)于實驗室動物的護理和使用指南進行喂養(yǎng)，將它們飼養(yǎng)在單獨的籠中，標(biāo)記并允許自由移動、自由進食與飲水，在實驗開始之前實驗動物在籠子里至少喂養(yǎng) 14 d，以馴化達到實驗條件。

2 儀器與試劑 臺式離心機(LD5-2A 型，北京醫(yī)用離心機廠)，骨碎補(廣西骨傷醫(yī)院藥劑科提供。水煎濃縮成含藥物濃度1 g/ml的藥液備用)，青霉素，電鉆，2 mm克氏針，戍巴比妥，4%多聚甲醛，0.5%碘伏，酒精，數(shù)碼相機，自動剃毛機，Skyscan 1176 Micro-CT機(德國Bruker公司)，Zwick IZ010型萬能材料測試機(德國Zwick/Roell公司)。

3 PRP的制備 采用含 0.8 ml 10% 枸椽酸鈉的注射器，于每只兔耳中央動脈抽取 5 ml 動脈血。采用 Landesberg 法[5]制備 PRP ：兩次離心轉(zhuǎn)數(shù)均為1100轉(zhuǎn)/min、離心半徑為15cm，時間均為8min，全血分為3層，取上清、交界層及交界層下少量紅細(xì)胞行二次離心，吸除上層貧血小板血漿，剩余1 ml即為富血小板血漿，加入微量(0.1 ml)激活劑氯化鈣。

4 實驗分組及方法 將 72 只大白兔隨機分成四組(n=18)，分別為富血小板血漿聯(lián)合骨碎補組，富血小板血漿組，骨碎補組，空白組，每組隨機取一側(cè)下肢行自體單股半腱肌腱移植重建ACL。手術(shù)前禁飲食 12 h，術(shù)前術(shù)區(qū)備皮、稱重，以 2.5%戊巴比妥鈉(40mg/kg)靜脈麻醉；0.5%碘伏消毒術(shù)野、鋪巾。沿膝關(guān)節(jié)髕骨旁內(nèi)側(cè)緣作一長約3 cm的縱行切口，依次切開皮膚，皮下組織，剝離半腱肌腱，在肌腱、肌肉結(jié)合處斷開，用4-0強生縫合線編制縫合。繼續(xù)分離關(guān)節(jié)囊，直至暴露前交叉韌帶，用眼科剪在韌帶的股骨及脛骨附著點切斷(圖1、2)。用直徑2 mm鉆頭制備脛骨及股骨隧道，將單股肌腱拉入骨隧道中，將絲線收緊打結(jié)，并將肌腱縫合于隧道外口周圍軟組織上，行懸吊固定，實驗組及富血小板血漿組脛骨、股骨骨隧道中分別注入PRP 0.5 ml，最后逐層縫合傷口。放回原籠中飼養(yǎng)，自由活動。術(shù)后3 d內(nèi)常規(guī)肌注青霉素40萬U/d 預(yù)防感染。

5 實驗干預(yù) 實驗組術(shù)后在骨隧道內(nèi)注入 1 ml RPP，同時于造模后第2天開始按骨碎補1 g/ml 劑量灌胃[6]，每只兔子使用4 ml制備藥液，生理鹽水稀釋成10 ml 后灌胃給藥，連續(xù)21 d。富血小板血漿組在骨隧道中注入1 ml RPP，骨碎補組于造模后第2天開始按骨碎補1.5 g/(kg·d)劑量灌胃，每只兔子使用4 ml制備藥液，生理鹽水稀釋成10 ml 后灌胃給藥，連續(xù)21 d?？瞻捉M則在術(shù)后不作任何特殊處理。

6 動物處死及取材

6.1 動物處死：分別在術(shù)后4、8、12周，每組隨機以耳緣靜脈空氣栓塞法(20 ml空氣)各處死6只兔子。

6.2 取材:外科操作完整取下手術(shù)側(cè)脛骨和股骨，剔除周圍皮膚肌肉和軟組織，保留關(guān)節(jié)內(nèi)外移植物，取下股骨-韌帶-脛骨復(fù)合體。

7 實驗觀察 兩組均隨機取一半標(biāo)本用生理鹽水紗布包裹保存于-80℃冰箱，擇期行生物力學(xué)測定。其余標(biāo)本置入4 %的多聚甲酪溶液中固定，行Micro-CT掃描。

7.1 生物力學(xué)測定[7]：①檢測前1 d將標(biāo)本從-80℃冰箱，放于4℃冰箱過夜。②小心剔除膝關(guān)節(jié)中除重建的前交叉韌帶之外的所有肌肉、軟組織、韌帶和縫線，避免影響生物力學(xué)檢測。③恒溫下(25℃，濕度65%)，用Zwick IZ010型萬能材料測試機行生物力學(xué)檢測，設(shè)置拉伸速度為5mm/min，量程100N。④將股骨-韌帶-脛骨復(fù)合體置于生物力學(xué)測試儀中進行最大載荷拉伸試驗，詳細(xì)觀察并記錄將重建的前交叉韌帶帶從股骨或脛骨的骨隧道中拉出或?qū)㈨g帶帶拉斷的最大加載負(fù)荷，并計算其剛度。

7.2 Micro-CT掃描：兩組取另一半標(biāo)本，使用 Micro-CT(Sky Scan 1076，USA)進行掃描，掃描厚度為20μm，X線電壓 80 kV，電流 312 μA 。所有標(biāo)本均行三維CT重建，獲取圖像后用Data Viewer 與CT vox軟件進行圖像分析及重建，測量股骨骨隧道擴大寬度(即術(shù)后各時間點股骨骨隧道內(nèi)口大小減去鉆頭直徑2mm)大小(圖3)。同時通過Micro-CT測定腱骨結(jié)合處骨組織的骨密度(BMD)(圖4)。

結(jié) 果

術(shù)后10 d時實驗組及骨碎補組分別有1個關(guān)節(jié)出現(xiàn)感染而致兔子死亡，去除死亡動物后予補充。

1 術(shù)后股骨骨隧道內(nèi)口擴大寬度 在 ACL 重建術(shù)后4、8、12周各組比較可見：實驗組股骨骨隧道內(nèi)口擴大寬度均小于富血小板血漿組、骨碎補組、空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；富血小板血漿組、骨碎補均小于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；富血小板血漿組各時間點隧道內(nèi)口擴大寬度雖小于骨碎補組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2 骨密度(BMD)測定 術(shù)后4、8、12周，實驗組腱骨結(jié)合處骨密度均較高于富血小板血漿組、骨碎補組、空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；骨碎補組各時間點腱骨結(jié)合處骨密度高于富血小板血漿組和空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；富血小板血漿組各時間點腱骨結(jié)合處骨密度高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 術(shù)后四組標(biāo)本股骨骨隧道內(nèi)口擴大寬度比較

組 別n4周骨隧道內(nèi)口寬度8周骨隧道內(nèi)口寬度12周骨隧道內(nèi)口寬度實驗組30.470±0.017*△▲0.413±0.015*△▲0.353±0.025*△▲富血小板血漿組30.553±0.040▲0.523±0.049▲0.460±0.044▲骨碎補組30. 600±0.030▲0.583±0.021▲0.530±0.035▲空白組30.657±0.0150.677±0.0210.617±0.021

注:與富血小板血漿組比較，*P<0．05；與骨碎補組比較，△P<0．05；與空白組比較，▲P<0．05

表2 術(shù)后四組標(biāo)本骨密度(BMD)比較

注:與富血小板血漿組比較，*P<0．05；與骨碎補組比較，△P<0．05；與空白組比較，▲P<0．05。

3 生物力學(xué)測定 術(shù)后4、8、12周，實驗組標(biāo)本的最大加載負(fù)荷均高于富血小板血漿組、骨碎補組、空白組，除第4周加載負(fù)荷與富血小板血漿組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。富血小板血漿組第4、8周加載負(fù)荷均高于骨碎補組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第12周加載負(fù)荷小于骨碎補組，兩組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；富血小板血漿組各時間點加載負(fù)荷均大于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；骨碎補組第8、12周加載負(fù)荷大于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第4周加載負(fù)荷雖高于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組標(biāo)本最大加載負(fù)荷比較

注:與富血小板血漿組比較，*P<0．05；與骨碎補組比較，△P<0．05；與空白組比較，▲P<0．05

討論

現(xiàn)代藥理學(xué)表明，骨碎補的主要要用成分為柚皮甙和總黃酮。柚皮甙有抗氧化作用，可促進成骨細(xì)胞，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等成骨樣細(xì)胞的增殖和分化[8]。其機制被認(rèn)為是柚皮甙可下調(diào)成骨細(xì)胞中的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶，從而增強和促進成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達[9]。同時總黃酮可降低血液黏度，改善血液循環(huán)，起活血化瘀的作用，從而加快骨形成。楊麗等[10]通過觀察骨碎補水提液對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)骨向分化能力及轉(zhuǎn)化生長因子β1 (Transforming growth factor-β1 ，TGF-β1 )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的影響，結(jié)果得出，骨碎補可促進TGF-β1 和BMP-2 的表達，而TGF-β1 和BMP-2均有調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的功能，可在成骨及骨基質(zhì)合成中起重要作用。楊淵等[11]經(jīng)體外實驗也證明成骨細(xì)胞經(jīng)柚皮甙誘導(dǎo)后，由于富含堿性磷酸酶，可合成I型膠原，形成鈣化結(jié)節(jié)，促進MSCs的增殖和分化，加快成骨。

PRP含有大量生長因子及蛋白質(zhì)，具有促進組織愈合和組織再生的功能，現(xiàn)在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎[12]、軟骨缺損、骨不連[13]、肱骨外上髁炎[14]、跟腱炎等各種疾病。因PRP含有大量的生長因子，可以誘導(dǎo)成骨且不引起自身的免疫反應(yīng)，同時能促進肌肉組織和骨組織愈合及再生[15]。張健等[16]將兔子分為對照組和PRP組，將其前交叉韌帶切斷，同時取同側(cè)自體半腱肌重建 ACL，對照組在骨隧道填充200 μl FG，而PRP組則在骨隧道填充 2 ml APRP + 200 μl FG，于術(shù)后 4、8、12周取實驗標(biāo)本，行HE 染色、VEGF 免疫組化。結(jié)果顯示，術(shù)后4周對照組HE染色可見腱-骨處形成瘢痕組織，而同期PRP組則見肉芽組織，局部可見類軟骨細(xì)胞；術(shù)后8周對照組可見腱-骨處形成相對成熟的瘢痕組織，同時出現(xiàn)密實的膠原纖維連接，同期PRP組已經(jīng)出現(xiàn)成熟的軟骨細(xì)胞；術(shù)后12周對照組見腱-骨連接處出現(xiàn)纖維軟骨細(xì)胞，PRP組則見膠原纖維錨于骨質(zhì)，同時可見較多的纖維軟骨細(xì)胞，而且形態(tài)上，PRP組已接近正常ACL解剖結(jié)構(gòu)，由此可見，ACL重建術(shù)后，生長因子在韌帶的生長愈合過程中起重要作用。趙耀等[17]也發(fā)現(xiàn)，PRP復(fù)合小牛脫蛋白制成凝膠擁有良好的生物相容性，可誘導(dǎo)骨生長，促進ACL重建術(shù)后腱-骨的愈合。

由于內(nèi)在壞境、營養(yǎng)、功能的特殊性，ACL的愈合能力非常有限。同時，ACL內(nèi)含 Ⅰ 型膠原少，而 Ⅲ 型膠原含量較多，因此，其膠原交聯(lián)程度較其他韌帶高，當(dāng)ACL在受到生長因子刺激后，細(xì)胞的前移，增殖，基質(zhì)合成方面弱于其他韌帶。韌帶的愈合主要有膠原參與，而生長因子能提高膠原的表達及生成。本研究將中藥骨碎補與PRP結(jié)合起來，用于ACL斷裂的治療，PRP中富含的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進移植物的血管再生，血小板類生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)可加速韌帶的成熟，增強其抗拉能力。同時PRP中富含的生長因子以及骨碎補中的柚皮甙均可提高Ⅰ型膠原的表達及合成，對韌帶的腱-骨愈合起積極作用。本實驗結(jié)果也顯示，骨碎補聯(lián)合PRP組的骨隧道愈合情況、及肌腱的生物力學(xué)以及骨密度測定等指標(biāo)均較PRP組好。因而，在PRP廣泛運用于臨床的時代，將傳統(tǒng)中藥骨碎補與PRP結(jié)合，可起到加快ACL重建后腱骨愈合、加強重建肌腱的韌性等作用。

可見，骨碎補聯(lián)合PRP 可加促進兔腱骨愈合，加強重建肌腱的韌性。