邊虹錚，劉麗芳

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術學院 制藥工程系，河北 石家莊 050031）

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎，是一種以膠原纖維為主的細胞外基質(zhì)彌漫性過度增生、沉積并逐漸發(fā)展致肝硬化的結締組織主動增生過程[1]。肝纖維化的過程已被公認為是可逆的，因此早期控制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化，減少肝硬化從而可以抑制門靜脈高壓、肝癌的發(fā)生，具有重要意義。紫杉醇是在紅豆杉的樹皮分離提純的天然次生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗腫瘤作用，臨床上廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分頭頸癌和肺癌的治療[2-3]。近年來國內(nèi)外相關研究發(fā)現(xiàn)低劑量紫杉醇對肝纖維化具有明顯的抑制作用，但主要集中在體外實驗。本研究采用牛血清白蛋白（BSA）誘導的免疫性肝纖維化大鼠模型，探討紫杉醇在體內(nèi)的治療作用及機制，為臨床使用紫杉醇防治肝纖維化提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠100只，均為雄性，4～6周齡，體質(zhì)量為150～170 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[批號：SCXK（京）2016-0032，合格證號：11600700047345]，于我院實驗動物中心適應性飼養(yǎng)7 d進行實驗。溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h明暗交替。

1.2 藥品與試劑

注射用紫杉醇脂質(zhì)體購自南京綠葉制藥有限公司，給藥時予葡萄糖生理鹽水稀釋至相應濃度。BSA及弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；戊巴比妥鈉北京大田豐拓化學技術有限公司；羥脯氨酸（Hyp）試劑盒及總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠透明質(zhì)酸（HA）、層黏蛋白（LN）、III型前膠原（PCIII）、IV型膠原（IVC）及同型二抗ELISA試劑盒與抗α-SMA單抗、抗TGF-β1單抗及相關試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。Western blot全套試劑購自美國BD公司。TRIzol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Platinum Taq DNA聚合酶購自美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 肝纖維化大鼠模型制備 模型制備方法參照文獻[4-5]方法并略加修改。實驗大鼠于第2、4、5、6、7周皮下多點注射9 mg/mL BSA弗氏不完全佐劑乳劑沖擊免疫接種，每次0.5 mL，共注射5次。第8周內(nèi)眥采血通過瓊脂平板雙向擴散法驗證大鼠是否產(chǎn)生BSA抗體。取BSA抗體陽性大鼠，尾靜脈攻擊注射BSA生理鹽水溶液0.4 mL/次/只，每周2次，劑量為每次2.0 mg逐漸遞增為3.6 mg，共攻擊注射15次。對照組同期注射等體積生理鹽水。

1.3.2 實驗分組及處理 將成模大鼠隨機分為模型組（尾靜脈注射葡萄糖生理鹽水）與紫杉醇組處理（尾靜脈注射10 μg/g紫杉醇）。每天注射1次，連續(xù)給藥28 d。另取10只正常大鼠作為對照組，處理同模型組。由于時間較長，部分大鼠實驗過程中死亡，最終獲得鼠數(shù)為模型組15只、紫杉醇組處理13只，對照組10只大鼠均存活。

1.3.3 標本采集 末次給藥后10～12 h采用45 μg/g戊巴比妥鈉麻醉，稱重后腹主靜脈取血并離心收集血清。放血處死大鼠后，迅速摘取肝臟并稱重。肝臟分為3部分：⑴ 取大鼠肝臟右葉縱斷面標本1塊，厚度約為2 mm，4%多聚甲醛固定24～36 h后，移去固定液，雙蒸水沖洗2次，梯度酒精脫水：75%15 min、85% 15 min、95% 15 min、95% 90 min、100% 20 min、100% 20 min； 二 甲 苯 I、II各20 min透明，浸蠟20 min，蠟溫65 ℃包埋組織標本，采用McIlwain組織切片機切片，切片厚度4 μm，55 ℃攤片，HE及Masson染色，中性樹膠封片。⑵ 剪取0.5 g肝組織檢測Hyp含量。⑶ 剩余肝組織5 mL 0.1%膠原酶IV和5 mL 0.1%鏈霉蛋白酶消化后，200目尼龍濾網(wǎng)研磨制備成肝細胞懸液，參照文獻[6]方法以40% Percoll分離液非灌流分離肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC），免疫組化鑒定α-SMA陽性率＞95%。

1.3.4 指標檢測 全自動生化分析儀檢測血清中TP、ALB、AST、ALT濃度。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清HA、LN、PCIII、IV-C水平。采用樣本水解法檢測Hyp含量，按試劑盒說明書進行操作。肝臟石蠟包埋組織連續(xù)切片，切片厚度4 μm，HE染色進行細胞形態(tài)觀察，并對纖維化程度進行分期及計分[7]（0期：無纖維化；1期：匯管區(qū)纖維化擴大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化；2期：匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留；3期：纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；4期：早期肝硬化）；采用半定量計分系統(tǒng)[8]進行纖維化計分。EnVision二兩步法α-SMA、TGF-β1免疫組化染色并進行分級及計分[9]。離心收集1×106個HSC，冰上裂解（RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟按100∶1混勻）30 min，Western blot法檢測轉(zhuǎn)化生長因子β亞單位受體1（TβRI）、磷酸化（p）-smad2、p-Smad3、纖溶酶原活物抑制因子1（PAL-1）的蛋白相對表達水平，以β-actin為內(nèi)參。TRIzol試劑盒提取HSC總RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-time PCR反應檢測TβRI、PAL-1 mRNA水平。引物序列見表1，由上海生工生物有限公司合成。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 30 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，方差齊的資料組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD-t檢驗進一步行兩兩比較；方差不齊的資料組間比較采用Welch檢驗，并采用Tamhane's T2法進一步行兩兩比較。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（范圍）[M（范圍）]表示，采用Kruskal-Wallis檢驗進行組間比較，組間比較有統(tǒng)計學意義的變量進一步進行兩兩比較，將P值進行Bonferroni校正。單項有序的分類資料采用Ridit檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 肝組織病理學觀察

對照組肝組織結構基本正常，匯管區(qū)無擴大，小葉結構完整，未見纖維間隔。模型組肝小葉中央靜脈增厚，呈環(huán)狀并延伸至臨近的肝細胞，竇周間隙增寬，彌散性纖維化，匯管區(qū)結節(jié)狀改變，伴結締組織沉淀及炎性細胞浸潤。紫杉醇處理組大鼠匯管區(qū)及小葉纖維組織增生程度減輕，界板相對完整，小葉結構基本完整，竇周無明顯纖維化，較少炎性細胞浸潤（圖1-2）。各組大鼠肝纖維化程度見表2。

圖1 大鼠肝組織HE染色（×100） A：對照組；B：模型組；C：紫杉醇處理組Figure 1 HE staining of the rat liver tissues (×100) A: Control group; B: Model group; C: Paclitaxel treatment group

圖2 大鼠肝組織Masson染色（×100） A：對照組；B：模型組；C：紫杉醇處理組Figure 2 Masson staining of the rat liver tissues (×100) A: Control group; B: Model group; C: Paclitaxel treatment group

表2 各組大鼠肝纖維化程度比較Table 2 Comparison of the degrees of liver fibrosis among groups of rats

2.2 血清肝功能生化指標比較

各組間TB差異無統(tǒng)計學意義（F=1.352，P=0.256），但ALB、AST、ALT差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與對照組相比，模型組ALB明顯減低，AST、ALT水平明顯增高（均P＜0.05）。紫杉醇脂質(zhì)體治療后，ALB水平明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），ALB與AST水平可基本恢復至正常水平，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（表3）。

表3 各組大鼠血清生化指標比較Table 3 Comparison of the biochemical indexes among groups of rats

2.3 血清膠原相關指標及肝組織Hyp比較

模型組血清HA、LN、PCIII及IV-C水平與肝組織Hyp水平均明顯高于對照組（均P＜0.05）。紫杉醇治療組血清HA、LN、PCIII及IV-C水平以及肝組織Hyp水平均較模型組降低（均P＜0.05）（表4）。

表4 各組大鼠血清膠原相關指標及肝組織Hyp水平Table 4 Comparison of the collagen-related variables in the serum and Hyp levels in the liver tissues among groups of rats

2.4 肝組織α-SMA、TGF-β1表達比較

模型組α-SMA、TGF-β1陽性率均為100.0%，與對照組比較明顯升高（均P＜0.05）。紫杉醇處理組α-SMA、TGF-β1表達均較模型組減低（均P＜0.05），且TGF-β1表達與對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖3-4）（表5）。

圖3 α-SMA免疫組化染色（×400） A：對照組；B：模型組；C：紫杉醇處理組Figure 3 Immunohistochemical staining for α-SMA (×400) A: Control group; B: Model group; C: Paclitaxel treatment group

圖4 TGF-β1免疫組化染色（×400） A：對照組；B：模型組；C：紫杉醇處理組Figure 4 Immunohistochemical staining for TGF-β1 (×400) A: Control group; B: Model group; C: Paclitaxel treatment group

表5 各組肝組織α-SMA、TGF-β1表達Table 5 Expressions of α-SMA and TGF-β1 in the liver tissues among groups of rats

2.5 HSC中TGF-β/Smad信號傳導通路相關蛋白及mRNA表達情況

HSC中，各組p-Smad2蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；模型組TβRI、p-Smad3、PAL-1蛋白及mRNA均高于對照組（均P＞0.05），而紫杉醇處理組TβRI、p-Smad3、PAL-1蛋白及mRNA均低于模型組（均P＞0.05），且除PAL-1 mRNA水平高于對照組外，其他與對照組比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）（表6-7）。

表6 各組HSC中TβRI、p-Smad2、p-Smad3、PAL-1蛋白表達水平（±s）Table 6 The protein expressions of TβRI, p-Smad2, p-Smad3 and PAL-1 in HSCs among groups (±s)

表6 各組HSC中TβRI、p-Smad2、p-Smad3、PAL-1蛋白表達水平（±s）Table 6 The protein expressions of TβRI, p-Smad2, p-Smad3 and PAL-1 in HSCs among groups (±s)

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. control group; 2) P＜0.05 vs. model group

組別 n TβRI p-Smad2 p-Smad3 PAL-1對照組 10 0.176±0.032 0.312±0.057 0.224±0.071 0.172±0.023模型組 15 0.502±0.0361) 0.337±0.052 0.455±0.0681) 0.350±0.0471)紫杉醇處理組 13 0.197±0.0202) 0.307±0.029 0.274±0.0582) 0.193±0.0622)

表7 各組HSC中TβRI、PAL-1 mRNA表達水平（±s）Table 7 The mRNA expressions of TβRI and PAL-1 in HSCs among groups (±s)

表7 各組HSC中TβRI、PAL-1 mRNA表達水平（±s）Table 7 The mRNA expressions of TβRI and PAL-1 in HSCs among groups (±s)

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. control group; 2) P＜0.05 vs. model group

組別 n TβRI p-Smad PAL-1對照組 10 2.43±0.21 1.78±0.32 1.05±0.08模型組 15 4.72±0.331) 3.89±0.471) 2.36±0.131)紫杉醇處理組 13 2.66±0.262) 1.95±0.372) 1.81±0.251), 2)

3 討 論

肝纖維化是肝臟中膠原蛋白等細胞外基質(zhì)合成和降解失去平衡，在竇周間隙過度沉積，繼之肝竇毛細血管纖維化，造成纖維在肝臟內(nèi)沉積過多的病理過程[1]。目前肝纖維化大鼠有多種造模方式[10]，本研究采用BSA誘導的免疫性肝纖維模型大鼠進行實驗，此模型在致病因素上屬于免疫損傷，更接近于病毒、炎癥誘發(fā)的人類肝纖維化形成，且自愈性低，便于觀察藥物的治療作用[4,10-11]。本研究模型組大鼠肝臟纖維結締組織增生并存在彌漫性假小葉，竇間纖維間隔形成，而肝實質(zhì)細胞可見輕微炎性浸潤，血清HA、LN、PCIII、IV-C“肝纖四項”及肝組織α-SMA、TGF-β1、Hyp表達明顯增高，提示纖維化模型構建成功。但本研究中模型組AST、ALT明顯升高，ALB水平降低，考慮與本組肝臟細胞受損有關。

劉洋等[12]研究顯示，低濃度紫杉醇（200 nmol/L）可以通過阻斷TGF-β/Smad信號傳導通路，下調(diào)膠原蛋白表達水平，從而逆轉(zhuǎn)免疫性大鼠的肝纖維化狀態(tài)。之后國內(nèi)相關研究對博來霉素誘導的大鼠肝纖維模型[13]、CCl4誘導的SD大鼠肝纖維模型[14]、二甲基亞硝胺誘導的Wistar大鼠肝纖維化模型[15]進行研究，均證實低劑量紫杉醇對不同類型的大鼠肝纖維化模型有較好治療作用。本研究參考上述文獻及預實驗數(shù)據(jù)，采用10 μg/g紫杉醇為動物實驗所用劑量。

LN是細胞基底膜的主要成分，肝纖維化時明顯增多，HA隨著肝纖維化的加重而增高，血竇內(nèi)皮細胞功能低下時HA升高更為明顯。PCIII為反映肝臟纖維增生的指標，其含量與肝纖維化程度呈正相關。Hyp為膠原蛋白所特有，肝纖維化時肝內(nèi)主要增多的成分即為膠原纖維。本研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇脂質(zhì)體能明顯降低肝纖維化時升高的血清LN、HA，PCIII、IV-C及肝組織Hyp含量，而且，紫杉醇亦能降低BSA誘導的纖維化大鼠血清AST、ALT水平，肝纖維化程度分期和積分均明顯減低。

免疫組化結果顯示，肝組織中HSC活化標志α-SMA與TGF-β1表達明顯增高。TGF-β1是促肝纖維化重要的細胞因子，在肝纖維化的過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明TGF-β/Smad信號傳導通路是TGF-β1發(fā)揮生物作用的主要通路，TGF-β/Smad信號通路主要由配體（TGF-β超家族）、受體（TGF-βR超家族）、信號傳遞分子（Smad家族）構成。其主要過程為配體激活受體后，由多種Smad分子將膜信號傳導到細胞核內(nèi)引起基因的表達轉(zhuǎn)錄，使細胞外基質(zhì)大量異常合成并抑制其分解，導致肝纖維化[20]。PAL-1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，可阻止纖溶酶激活纖溶酶原導致ECM過多沉積。PAL-1的啟動子上均存在有Smad結合位點（SBE），因而TGF-β1可能通過TGFβ信號通路傳導促進PAL-1的分泌來促進肝纖維化[21]。相關研究[22]證實，在通過TGF-β1激活的大鼠HSC中，加入200 nmol/L濃度的紫杉醇能通過抑制磷酸化的Smad3來改善纖維化程度。本研究結果顯示，紫杉醇組HSC中TβRI、p-Smad3、PAL-1蛋白及mRNA均較模型組明顯下調(diào)，提示紫杉醇通過降低TRβI表達，減少TRβI的磷酸化作用，從而降低了Smad3的磷酸化水平，導致co-Smad轉(zhuǎn)移至細胞核的信號相對減少。又通過抑制PAL-1基因的表達，使PAL-1蛋白質(zhì)和mRNA的表達減少，從而促進了細胞外基質(zhì)的降解，減輕了肝纖維化。

綜上，本研究證實低劑量紫杉醇可下調(diào)TGF-β/Smad信號通路蛋白及mRNA的表達，同時下調(diào)HA、LN、PCIII、IV-C水平及血清AST、ALT水平，故推測其機制是通過抑制TGF-β/Smad信號通路，來下調(diào)HA、LN、PCIII、IV-C水平的，今后待進一步通過敲除TGF-β/Smad信號通路相關基因來進一步證實。