賀林華，華頌文，李勁東

（1. 湖南司法警官職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410131；2. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410011；3. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙410008）

膽管癌的診斷和治療一直是醫(yī)學(xué)界的一大難題。多數(shù)患者在診斷早期即發(fā)生廣泛浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此外，膽管癌極易發(fā)生多重耐藥抵抗，導(dǎo)致膽管癌患者預(yù)后極差，其5年生存率不足5%[1-4]。膽管癌的的進(jìn)展涉及復(fù)雜的基因及表觀遺傳改變[5-8]。因此，為了尋找新的有效的治療方法，有必要進(jìn)一步揭示膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

CARMA3是半胱天冬酶募集域（caspase recruitment domain，CARD）和膜相關(guān)的鳥苷酸激酶樣域（membrane-associated guanylate kinase-like domain，GUK）基因，是CARMA家族成員之一[9-11]。研究表明，CARMA3在乳腺癌[12]、卵巢癌[13]、結(jié)腸癌[14]和腎癌[15]等腫瘤中表達(dá)異常上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。然而，CARMA3在膽管癌組織中的表達(dá)及功能，尚無研究報(bào)道。因此，本研究擬利用qPCR、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測CARMA3在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)及功能，研究有望為膽管癌的靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RPMI-1640培養(yǎng)液（美國HyClone），青霉素-鏈霉素雙抗（美國HyClone），胎牛血清（美國Gibco）。反轉(zhuǎn)錄及RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），qRT-PCR所應(yīng)用的Real Master Mix試劑盒（天根生化科技有限公司）。FITC標(biāo)記的Annexin-V抗體及PI染料試劑盒（美國Biolegend）。液氮灌（美國Thermo），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo），Transwell小室（美國Millipore），基質(zhì)膠（美國BD），ABI 7900型PCR儀（美國ABI），BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD）。人膽管癌細(xì)胞系HUCCT1、RBE，正常膽管細(xì)胞系HIBEC購買于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膽管癌細(xì)胞系HUCCT1、RBE和正常膽管細(xì)胞系HIBEC用含10%濃度胎牛血清及1%濃度的青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%濃度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度值80%后傳代。

1.2.2 RNA提取 TRIzol裂解人膽管癌組織或細(xì)胞系，加入1/5體積氯仿，震蕩14 s。4 ℃，12 000r/min離心15 min，吸取水相層，而后加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10 min。4 ℃，12 000r/min離心10 min，棄去上清，所得膠狀沉淀即為RNA。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。而后加入125 μL的 20×SYBR 溶 液 至 1.0 mL 2.5x Real Master Mix中，所得溶液作為試劑A。實(shí)驗(yàn)采用20 μL 體系，內(nèi)還有 9 μL 試劑 A，1 μL 20×ROX Reference Dye ，1 μL 正向引物，1 μL 反向引物，cDNA模板 2 μL，6 μL去離子水。qRT-PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。CARMA3正向引物序列為：5'-TCT TCC ACC GTT GCC AAT CT-3'；負(fù)向引物序列為：5'-TTC GCC TGC CAG GAA CAT C-3'。

1.2.4 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染 0.5×106膽 管 癌 HUCCT1或RBE細(xì)胞鋪6孔板，過夜培養(yǎng)至50%匯合度，5 μL CARMA3 siRNA或陰性對(duì)照序列（30 pmol）稀釋至250 μL無血清培養(yǎng)基，5 μL轉(zhuǎn)染試劑lipo2000稀釋至250 μL無血清培養(yǎng)基，兩者混合室溫孵育20 min。將混合物加入膽管癌細(xì)胞中，6 h后更換為完全培養(yǎng)基。48 h行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測沉默效率，并進(jìn)行后續(xù)功能學(xué)試驗(yàn)。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的人膽管癌細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液，以2.0×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1～5 d，各孔中加入10 μL CCK-8試劑 ，培養(yǎng)1 h后，在450 nm波長處測定吸光度值，所得數(shù)據(jù)作為第1天的OD值。而后每天在同一時(shí)間 再次加入CCK-8試劑培養(yǎng)1 h后測定吸光度值，根據(jù)5 d內(nèi)各組所得OD值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期 取對(duì)數(shù)生長期的人膽管癌細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液。10 mL PBS，1 000r/min離心10 min，反復(fù)洗滌3次，棄去上清；若檢測細(xì)胞周期則在各組細(xì)胞中加入 100 μL 流式洗液和 PI（50 μg/mL）5 μL 或同型對(duì)照抗體，避光反應(yīng)15 min后。尼龍膜過濾細(xì)胞，除去細(xì)胞團(tuán)塊后，立即利用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測。若檢測細(xì)胞凋亡則在清洗細(xì)胞后加入 FITC標(biāo)記的 Annexin-V（20 ug/mL）10 μL及再加入 PI（50 μg/mL）5 μL 或 Annexin-V 及 PI的同型對(duì)照抗體，避光反應(yīng)15 min。尼龍膜過濾細(xì)胞，除去細(xì)胞團(tuán)塊后，立即利用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 Transwell檢測細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移 細(xì)胞轉(zhuǎn)移步驟簡述如下：取對(duì)數(shù)生長期的人膽管癌細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將2萬個(gè)細(xì)胞鋪于已加入190 μL無血清培養(yǎng)基的上室中，下室中加入600 μL含10%血清的1640培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后用棉簽擦去上層未穿過小室的細(xì)胞，95%酒精固定10 min，1%結(jié)晶紫染色5 min。顯微鏡下隨機(jī)區(qū)十個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)后取平均值 。細(xì)胞侵襲步驟大體同上，區(qū)別在于預(yù)先在Transwell小室上層鋪基質(zhì)膠。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，統(tǒng)計(jì)3次試驗(yàn)中各組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，分析CARMA3 siRNA組與陰性對(duì)照組組侵襲及轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS statistic 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間增殖差異比較采用方差分析，兩組間其他指標(biāo)差異的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CARMA3 mRNA在膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示：設(shè)CARMAR3 mRNA在正常膽管細(xì)胞系HIBEC中的相對(duì)表達(dá)量為1，在膽管癌細(xì)胞RBE中的相對(duì)表達(dá)量為3.722±0.193，在膽管癌細(xì)胞HUCCT1中的相對(duì)表達(dá)量為4.913±0.117。方差分析結(jié)果顯示，3組間CARMA3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.324，P=0.015）（圖1）。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CARMA3在HUCCT1和HIBEC兩組間及RBE與HIBEC兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1vs.HIBEC：t=5.321，P=0.011；RBEvs.HIBEC：t=5.932，P=0.008），膽管癌細(xì)胞中CARMA3的表達(dá)水平高于正常膽管細(xì)胞系。

圖1 CARMA3 mRNA在膽管癌細(xì)胞及正常膽管細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 The relative expression levels of CARMA3 mRNA in cholangiocarcinoma cells and normal bile duct epithelial cells

2.2 CARMA3-siRNA在膽管癌細(xì)胞中的沉默效率

qRT-PCR結(jié)果顯示：設(shè)轉(zhuǎn)染CARMA3-陰性對(duì)照序列的膽管癌細(xì)胞HUCCT1和RBE CARMA3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1，轉(zhuǎn)染CARMA3-siRNA的膽管癌細(xì)胞HUCCT1和RBE中CARMA3的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.438±0.082和0.311±0.037，經(jīng)t檢驗(yàn)，陰性對(duì)照組與CARMA3-siRNA組間CARMA3表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1：t=3.226，P=0.036；RBE：t=4.171，P=0.027）（圖2）。

圖2 CARMA3-siRNA在膽管癌細(xì)胞中的沉默效率Figure 2 Silence efficiency of CARMA3-siRNA in cholangiocarcinoma cells

2.3 CARMA3對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，自轉(zhuǎn)染后第2日起轉(zhuǎn)染CARMA3-陰性對(duì)照序的HUCCT1和RBE細(xì)胞OD值明顯高于CARM3-siRNA組。經(jīng)方差分析，兩組的細(xì)胞增殖水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1：F=14.543，P=0.007；RBE：F=9.543，P=0.012）（圖3）。

圖3 CARMA3基因沉默對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of CARMAE gene silencing on proliferation of cholangiocarcinoma cells

2.4 CARMA3對(duì)膽管癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CARMA3-陰性對(duì)照序的HUCCT1和RBE細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例為（1.321±0.155）%和（1.923±0.124）%，轉(zhuǎn)染CARMA3-siRNA的HUCCT1和RBE細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例為（13.235±2.515）%和（10.872±2.324）%。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組的細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1：t=5.843，P=0.017；RBE：t=4.712，P=0.021）（圖4）。

圖4 CARMA3基因沉默對(duì)膽管癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of CARMAE gene silencing on apoptosis in cholangiocarcinoma cells

2.5 CARMA3對(duì)膽管癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測周期結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CARMA3-陰性對(duì)照序的HUCCT1和RBE細(xì)胞G1期細(xì)胞比例為（54.323±5.321）%和（45.322±4.123）%，轉(zhuǎn)染CARMA3-siRNA的HUCCT1和RBE細(xì)胞G1期細(xì)胞比例為（70.727±4.319）%和（63.342±5.552）%。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組的細(xì)胞G1期細(xì)胞差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1：t=3.279，P=0.038；RBE：t=3.413，P=0.035）（圖5）。

2.6 CARMA3對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell細(xì)胞遷移結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CARMA3-陰性對(duì)照序的HUCCT1和RBE細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目為133.239±32.529和121.394±24.642，轉(zhuǎn)染CARMA3-siRNA的HUCCT1和RBE細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目為54.325±23.105和42.195±10.423。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1：t=3.519，P=0.032；RBE：t=3.761，P=0.029）（圖6）。

2.7 CARMA3對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲的影響

Transwell細(xì)胞侵襲結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CARMA3-陰性對(duì)照序的HUCCT1和RBE細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目為94.541±28.532和65.176±23.541，轉(zhuǎn)染CARMA3-siRNA的HUCCT1和RBE細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目為35.819±15.394和31.571±14.562。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組的侵襲細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HUCCT1：t=4.642，P=0.025；RBE：t=3.547，P=0.034）（圖7）。

圖5 CARMA3基因沉默對(duì)膽管癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Figure 5 Effect of CARMAE gene silencing on cell cycle in cholangiocarcinoma cells

圖6 CARMA3基因沉默對(duì)膽管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響Figure 6 Effect of CARMAE gene silencing on cell migration in cholangiocarcinoma cells

圖7 CARMA3基因沉默對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲的影響Figure 7 Effect of CARMAE gene silencing on invasion in cholangiocarcinoma cells

3 討 論

本研究通過qRT-PCR檢測了CARMA3在膽管癌細(xì)胞系及正常膽管細(xì)胞系中的表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示CARMA3在膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。而后利用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了CARMA3對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示沉默膽管癌細(xì)胞中CARMA3的表達(dá)，可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并阻滯細(xì)胞周期于G1期。本研究結(jié)果提示CARMA3在膽管癌發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮致癌基因的作用。

CARMA3是細(xì)胞支架蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞中均可促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，如膀胱癌[16]、肺癌[17]等。與既往研究一致，本研究結(jié)果亦顯示，CARMA3可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡。既往機(jī)制研究結(jié)果顯示EGFR和GPCR可誘導(dǎo)細(xì)胞形成由CARMA3及其下游信號(hào)分子BCL10和MALT1組成的復(fù)合體[18]，并進(jìn)一步活化IKK。IKK可誘導(dǎo)I-κB的降解，從而活化NF-κB，并與DNA結(jié)合促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。此外，被活化的NF-κB可促進(jìn)超過150個(gè)靶基因轉(zhuǎn)錄，包括大量在細(xì)胞增殖、成管、轉(zhuǎn)移、凋亡、和化療抵抗的基因，是潛在的治療靶點(diǎn)[20]。研究表明抑制NF-κB通路可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[21]，侵襲轉(zhuǎn)移能力下降[22]。更為重要的是，研究[23]顯示NF-κB在膽管癌中表達(dá)異常上調(diào)，抑制NF-κB可在體內(nèi)和體外水平降低膽管癌細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)膽管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。因CARMA3可活化NF-κB通路，且NF-κB通路可促進(jìn)膽管癌的增殖及化療抵抗。而本研究中發(fā)現(xiàn)，CARMA3在膽管癌細(xì)胞中高表達(dá)，并可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。因此，筆者認(rèn)為CARMA3可能是通過活化NF-κB而發(fā)揮其致癌分子作用，從而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移?？紤]到NF-κB在膽管癌細(xì)胞化療抵抗中同樣發(fā)揮著重要作用[23-25]，而CARMA3又與NF-κB通路存在著密切的關(guān)系，因此，筆者擬在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討CARMA3與膽管癌細(xì)胞化療抵抗之間的關(guān)系，更深入探索CARMA3與NF-κB通路之間的關(guān)系。

綜上，本研究通過qRT-PCR、CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)CARMA3在膽管癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。CARMA3發(fā)揮癌基因作用的具體分子機(jī)制及其在化療抵抗方面的功能仍需進(jìn)一步的研究明確。本研究結(jié)果提示CARMA3在膽管癌中為潛在的致癌分子，可能是潛在的治療靶點(diǎn)。