掲偉，林江飛，肖強(qiáng)勝，聶晚頻

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410006）

膽囊癌（gallbladder cancer）是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，以惡性程度高，侵襲力強(qiáng)，轉(zhuǎn)移快，預(yù)后差為主要臨床特征[1]。手術(shù)切除仍是目前膽囊癌治療的首要方案，但大多數(shù)患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[2]。據(jù)報(bào)道[3]，膽囊癌中位生存期低于1年，5年生存率低于15%。為此，進(jìn)一步闡明膽囊癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并尋找新的分子標(biāo)志物對膽囊癌的防治具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度由19～24個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼 RNA[4]。miRNA可通過與靶基因信使RNA（mRNA）3'-非編碼區(qū)（UTR）堿基特異性互補(bǔ)配對而抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮對靶基因的直接調(diào)控作用[5]。研究[6]表明，miRNA與細(xì)胞生長、分化、凋亡及免疫反應(yīng)等過程密切相關(guān)。

近年來研究[7]顯示，一些miRNA的異常表達(dá)與人體腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，miR-217和miR-23a在胰腺癌中呈現(xiàn)異常表達(dá)，過表達(dá)miR-217可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[8]；而上調(diào)miR-23a則促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲[9]。miR-125a-5p在骨肉瘤呈現(xiàn)低表達(dá)，而體外增加其表達(dá)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。miR-106a和miR-20a在膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并發(fā)揮促癌作用[11]。miR-200c在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12]。miR-362-3p定位于人基因組Xp11.23區(qū)域，其在多種人類腫瘤組織中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用，如乳腺癌[13]、宮頸癌[14]及腎癌[15]等。目前關(guān)于miR-362-3p在膽囊癌中的功能及分子機(jī)制尚不明確。本研擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)分析miR-362-3p在膽囊癌中的表達(dá)特征，通過細(xì)胞功能試驗(yàn)明確其對膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并探討及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集本院肝膽外科2009年3月—2011年9月手術(shù)切除的44例膽囊癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本（距離腫瘤邊緣2 cm外）。所有患者術(shù)前均未接受腫瘤放療和化療，標(biāo)本收集后立即放置于液氮保存?zhèn)溆谩Ｋ袠?biāo)本均經(jīng)本院病理科進(jìn)行病理確診，臨床病理分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)的第7版腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期?；颊咝g(shù)后隨訪72個(gè)月，總體生存時(shí)間定義為手術(shù)到死亡或手術(shù)到最后觀察時(shí)間。本研究已獲得該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到患者和/或其直系家屬知情同意。

1.2 相關(guān)試劑

膽囊癌細(xì)胞系G-415和SGC-996購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及雙抗購自美國Gibco公司。RNA提取試劑盒、引物、轉(zhuǎn)染試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自美國賽默飛世爾公司。miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照購，NLK過表達(dá)載體和陰性對照載體均購自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司。MTT和二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1.3 RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及qRT-PCR檢測

參照TRIzol說明書提取組織RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，72 ℃ 10 min，-20 ℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 min，隨后98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。人miR-362-3p上游引物：5'-AAC ACA CCT ATT CAA GGA TTC A-3'，下游引物：通用引物；以人U6核內(nèi)小RNA（U6）為內(nèi)參，U6上游引物：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，下游引物：5'-ACG CTT CAC GAA TTT GCG T-3'。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算膽囊癌組織及細(xì)胞系中miR-362-3p的相對表達(dá)情況[16]。

1.4 MTT法

取對數(shù)期生長的G-415和SGC-996細(xì)胞，并于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行鋪板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為8×103個(gè)/孔。將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中過夜，待每孔細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照。隨后，每孔細(xì)胞中連續(xù)4 d加入15 μL MTT/d（5 mg/mL），放置培養(yǎng)箱孵育4 h并去掉上清，每孔細(xì)胞中加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶，置于常溫?fù)u床緩慢搖晃20 min，最后采用測酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長時(shí)的吸光度（OD值）。

1.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

取對數(shù)期生長的G-415和SGC-996細(xì)胞，并于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行鋪板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為4×105個(gè)/孔。將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中過夜，待每孔細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照。采用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6 h，用槍頭在每孔細(xì)胞中均勻劃出4條水平橫線，并以37 ℃ PBS洗滌各孔細(xì)胞，去除多余雜質(zhì)及懸浮細(xì)胞。隨后，采用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每隔6 h進(jìn)行拍照，觀察和測定各孔細(xì)胞劃痕寬度。

1.6 Transwell侵襲試驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染后的G-415和SGC-996細(xì)胞，并于BD Matrigel基質(zhì)膠/基質(zhì)膜包被的Transwell小室的上室中進(jìn)行鋪板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為2×104個(gè)/孔，隨后加入200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基；下室加入500 μL DMEM含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后，擦掉上室中未侵襲的細(xì)胞，采用多聚甲醛固定下室細(xì)胞，并以吉姆薩染液染色，最后放置顯微鏡下觀察每個(gè)視野中侵襲的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染后的G-415和SGC-996細(xì)胞，并于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行鋪板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為2×104個(gè)/孔。將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中過夜，待每孔細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物或模擬物陰性對照和野生型或突變型報(bào)告基因載體，并放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。隨后，以PBS清洗各孔細(xì)胞3次，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，置于常溫?fù)u床緩慢搖晃30 min并收集上清液，最后采用Modulus?單管型多功能檢測儀測量各孔海腎和螢火蟲熒光值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用配對t檢驗(yàn)比較膽囊癌和癌旁組織中miR-362-3p表達(dá)水平，以四格表χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析miR-362-3p表達(dá)水平與膽囊癌患者臨床病理特征的關(guān)系，以生存分析Kaplan-Meier法討論miR-362-3p表達(dá)水平與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系，其余統(tǒng)計(jì)分析采用Student'st或單因素方差分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-362-3p在膽囊癌和癌旁組織的表達(dá)特征

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-362-3p在膽囊癌組織和相應(yīng)癌旁組織的相對表達(dá)量分別為0.47±0.21和1.36±0.45。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，miR-362-3p在膽囊癌組織的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 miR-362-3p在膽囊癌和癌旁組織的表達(dá)特征Figure 1 The expression characteristics of miR-362-3p in gallbladder cancer tissues and corresponding adjacent tissues

2.2 miR-362-3p的表達(dá)與膽囊癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

以miR-362-3p表達(dá)量平均值（1.36）為界，將44例膽囊癌患者分為低表達(dá)miR-362-3p組及高表達(dá)miR-362-3p組，其中低表達(dá)miR-362-3p組有25例患者，高表達(dá)miR-362-3p組有19例患者。低表達(dá)miR-362-3p與膽囊癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小及膽囊結(jié)石無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

表1 miR-362-3p表達(dá)與膽囊癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系[n（%）]Table 1 The relations of miR-362-3p expression with clinicopathologic features of patients with gallbladder cancer [n (%)]

2.3 miR-362-3p表達(dá)與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示，低表達(dá)miR-362-3p組膽囊癌患者總體生存率較高表達(dá)miR-362-3p組患者明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同miR-362-3p表達(dá)狀態(tài)與膽囊癌患者的生存曲線Figure 2 The survival curves of gallbladder cancer patients with different miR-362-3p expression statuses

2.4 過表達(dá)miR-362-3p對膽囊癌細(xì)胞增殖的影響

G-415細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照后，細(xì)胞中miR-362-3p的相對表達(dá)量分別為10.20±3.16和1.0±0.17；SGC-996細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照后，細(xì)胞中miR-362-3p的相對表達(dá)量分別為13.06±2.97和1.0±0.20。統(tǒng)計(jì)分析顯示，體外轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物可明顯提高G-415和SGC-996細(xì)胞中miR-362-3p的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3A）。噻唑藍(lán)比色法顯示，體外過表達(dá)miR-362-3p可明顯抑制G-415和SGC-996細(xì)胞增殖（均P＜0.05）（圖3B）。

2.5 過表達(dá)miR-362-3p對膽囊癌細(xì)胞遷移的影響

膽囊癌細(xì)胞遷移24 h，G-415細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照后細(xì)胞遷移距離分別為96.4±26.7和578.3±75.2 μm；SGC-996細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照后細(xì)胞遷移距離分別為（391.8±51.4）μm和（704.7±95.9）μm。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，過表達(dá)miR-362-3p可明顯抑制G-415和SGC-996細(xì)胞遷移（P＜0.05）（圖4）。

圖3 過表達(dá)miR-362-3p對膽囊癌細(xì)胞增殖的影響 A：miR-362-3p相對表達(dá)量檢測；B：細(xì)胞增殖曲線Figure 3 Effect of miR-362-3p overexpression on proliferation of gallbladder carcinoma cells A: Determination of relative miR-362-3p expression levels; B: The cell proliferation curves

圖4 過表達(dá)miR-362-3p抑制膽囊癌細(xì)胞遷移的影響 A：G-415細(xì)胞；B：SGC-996細(xì)胞Figure 4 Effect of miR-362-3p overexpression on migration of gallbladder carcinoma cells A: G-415 cells; B: SGC-996 cells

2.6 過表達(dá)miR-362-3p對膽囊癌細(xì)胞侵襲的影響

Transwell侵襲試驗(yàn)如圖5所示，G-415細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照后細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（101.1±30.9）個(gè)和（261.3±47.8）個(gè)；SGC-996細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和模擬物陰性對照后細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（73.5±22.8）個(gè)和（229.6±54.2）個(gè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，過表達(dá)miR-362-3p可明顯抑制G-415和SGC-996細(xì)胞侵襲（P＜0.05）（圖5）。

圖5 體外過表達(dá)miR-362-3p抑制膽囊癌細(xì)胞侵襲 A：G-415細(xì)胞；B：SGC-996細(xì)胞Figure 5 Effect of miR-362-3p overexpression on invasion of gallbladder carcinoma cells A: G-415 cells; B: SGC-996 cells

2.7 miR-362-3p的靶基因分析結(jié)果

采用TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-362-3p可能的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nemo樣激酶（nemo like kinase，NLK）mRNA 3'-非編碼區(qū)（UTR）與miR-362-3p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（圖6A）。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-362-3p可直接與NLK mRNA 3'-UTR預(yù)測位點(diǎn)結(jié)合，并降低海腎/螢火蟲熒光比值；當(dāng)人為將上述結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-362-3p結(jié)合能力消失，相對熒光比值恢復(fù)正常（圖6B）。

2.8 miR-362-3p模擬物與NLK過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染對膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響

與共轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和陰性對照載體相比，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-362-3p模擬物和NLK過表達(dá)載體可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲（均P＜0.05）（圖7）。

圖6 miR-362-3p的靶基因分析 A：miR-362-3p與NLK mRNA 3'- UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測示意圖；B：雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-362-3p對NLK的直接調(diào)控作用Figure 6 Analysis of target gene for miR-362-3p A: The schematic diagram of NLK mRNA 3’-UTR binding site for miR-362-3p;B: Analysis of the directly regulatory effect of miR-362-3p on NLK by dual luciferase reporter gene assay

圖7 miR-362-3p模擬物與NLK過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染對膽囊癌細(xì)胞的影響 A-B：細(xì)胞增殖曲線；C：細(xì)胞遷移結(jié)果；D：細(xì)胞侵襲結(jié)果Figure 7 Effect of co-transfection of miR-362-3p mimics and NLK overexpression vectors on gallbladder carcinoma cells A–B: Cell proliferation; C: Cell migration; D: Cell invasion

3 討 論

膽囊癌是一種高致命性疾病，臨床預(yù)后較差。目前關(guān)于膽囊癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)分子制尚未完全闡明，因此針對該腫瘤機(jī)制的研究顯得尤為重要。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA的表達(dá)與膽囊癌臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，并參與調(diào)控腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[17]。例如，膽囊癌組織中miR-146b-5p表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)水平與腫瘤大小與生長有顯著相關(guān)性，過表達(dá)miR-146b-5p可抑制腫瘤生長[18]。低表達(dá)的miR-30a-5p與膽囊癌患者無病生存率和總體生存率呈負(fù)相關(guān)，體外抑制miR-30a-5p可增加膽囊癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移[19]。miR-29c-5p在膽囊癌中表達(dá)明顯下調(diào)，并與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、整體生存率和無病生存率相關(guān)，過表達(dá)miR-29c-5p可顯著抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移并增加凋亡[20]。與鄰近正常組織相比，膽囊癌組織中miR-133a-3p的表達(dá)明顯減少，過表達(dá)miR-133a-3p顯著抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[21]。

前面研究[13-15]報(bào)道，miR-362-3p在多種人類腫瘤組織中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用，如乳腺癌、宮頸癌及腎癌等。目前關(guān)于miR-362-3p在膽囊癌中的表達(dá)及功能尚不明確。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-362-3p在膽囊癌組織的表達(dá)量顯著低于癌旁組織，該結(jié)果與miR-362-3p在乳腺癌、宮頸癌及腎癌中表達(dá)一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-362-3p與膽囊癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低表達(dá)miR-362-3p組患者總體生存率較高表達(dá)miR-362-3p組患者顯著降低，因?yàn)橥茰ymiR-362-3p在膽囊癌中亦發(fā)揮抑癌作用。為證實(shí)上述科學(xué)假說，隨后采用噻唑藍(lán)比色法、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)及Transwell侵襲試驗(yàn)觀察過表達(dá)miR-362-3p對G-415和SGC-996細(xì)胞增殖、遷移及侵襲行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外過表達(dá)miR-362-3p可顯著抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖，遷移及侵襲，上述結(jié)果表明miR-362-3p在膽囊癌中發(fā)揮抑癌功能。

研究表明，miRNA通過堿基互補(bǔ)配對方式與靶基因的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。為進(jìn)一步闡明miR-362-3p調(diào)控膽囊癌發(fā)展發(fā)展的分子機(jī)制，筆者采用TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測其靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-362-3p可與NLK mRNA 3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合，提示NLK可能為miR-362-3p靶基因。NLK是一種促生線蟲樣激酶，亦是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路一種經(jīng)典中介，其在癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移中起重要作用[22]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，NLK在腫瘤中作為一些miRNA的靶基因發(fā)揮重要調(diào)控作用，包括miR-221[23]、miR-101[24]和miR-92b[25]等。本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-362-3p對NLK的直接調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-362-3p可直接與NLK mRNA 3'-UTR預(yù)測位點(diǎn)直接結(jié)合，并降低海腎/螢火蟲熒光比值；當(dāng)人為將上述結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-362-3p結(jié)合能力消失，相對熒光比值恢復(fù)正常。更為重要的是，采用功能補(bǔ)救試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NLK可部分逆轉(zhuǎn)miR-362-3p對膽囊癌細(xì)胞增殖，遷移及侵襲的抑制作用。上述結(jié)果充分證明miR-362-3p通過下調(diào)NLK抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-362-3p在膽囊癌中表達(dá)下調(diào)，并與臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)。過表達(dá)miR-362-3p通過下調(diào)NLK抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示miR-362-3p/NLK通路可能作為膽囊癌新的分子治療靶點(diǎn)。