劉勇,孫嘉婧

?

針刺介入時(shí)機(jī)對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b的影響

劉勇1,孫嘉婧2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

觀察不同針刺介入時(shí)間對(duì)局灶性腦缺血中風(fēng)模型大鼠腦組織細(xì)胞中雙特異性磷酸酶(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和磷酸化糖原合酶激酶-3b(p-GSK3b)的影響。將200只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(造模后2 h針刺組)、D組(造模后72 h針刺組)和E組(造模后168 h針刺組),每組40只。除A組外,其余各組均采用線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型。各組術(shù)后1 d、3 d、7 d及14 d分別采用Garcia復(fù)合評(píng)分法評(píng)定神經(jīng)功能,并采用Western Blot法和RT-PCR法檢測(cè)腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。與B組比較,C組和E組在不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)Garcia復(fù)合評(píng)分均顯著提高(＜0.01)。D組術(shù)后7 d和14 d Garcia復(fù)合評(píng)分與C組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d Garcia復(fù)合評(píng)分與C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。B組在不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN、p-AKT、p-GSK3b蛋白表達(dá)及PTEN mRNA、p-AKT mRNA、p-GSK3bmRNA表達(dá)與A組和C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組術(shù)后3 d、7 d和14 d PTEN、p-AKT、p-GSK3b蛋白表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組在不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA、p-AKT mRNA、p-GSK3bmRNA表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。針刺可顯著降低缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞中PTEN的表達(dá),顯著升高p-AKT和p-GSK3b的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡,保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)元細(xì)胞,且越早進(jìn)行針刺,效果越好。

針刺;腦梗死;中風(fēng);介入時(shí)機(jī);雙特異性磷酸酶;磷酸化蛋白激酶B;磷酸化糖原合酶激酶-3b;大鼠

針刺療法對(duì)于腦梗死的臨床治療是積極有效的。大量實(shí)驗(yàn)研究證明,針刺對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠的治療效果顯著[1]。雙特異性磷酸酶(PTEN)參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞周期[2],其表達(dá)升高可抑制磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表達(dá)[3]。而PI3K/AKT通路是神經(jīng)細(xì)胞再生的重要環(huán)節(jié),磷酸化糖原合酶激酶-3b(p-GSK3b)是PI3K/Akt通路的下游效應(yīng)靶點(diǎn)蛋白,p-GSK3b失活可阻止凋亡通路的激活。抑制PTEN的表達(dá)可促進(jìn)p-AKT和p-GSK3b的表達(dá)[4],從而促進(jìn)受損神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)和再生。本研究通過觀察不同針刺時(shí)機(jī)對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和GSK3b表達(dá)的影響,為尋找針刺治療腦梗死的最佳時(shí)機(jī)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用2月齡、體重為280～300 g的健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠250只(其中50只備用),購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)(SCXK黑2008004)。將200只大鼠隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(缺血2 h針刺組)、D組(缺血72 h針刺組)和E組(缺血168 h針刺組),每組40只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

電泳槽Mini P-4(Cavoy公司);MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);水平脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司);垂直電泳儀,半干槽,全自動(dòng)梯度PCR儀、PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(以色列MiniLumi公司);核酸電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio- Rad公司);pH儀(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2.2 主要試劑

1.2.2.1 WB實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液、電泳緩沖液、中分子量蛋白marker、NC膜、濕轉(zhuǎn)緩沖液、麗春紅染色液(賽諾博公司提供);蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Roche group);Trizma base、Glycine、T1503、SDS、Sodium deoxycholate (Sigma- Aldrich);山羊抗兔IgG、HRP,山羊抗小鼠IgG、GAPDH鼠單克隆抗體(天德悅公司提供);PTEN、p-AKT和p-GSK3b單抗(美國(guó)SANTACRUZ公司)。

1.2.2.2 RT-PCR所用試劑

Goldview染料、50XTAE電泳緩沖液(諾特萊斯生物科技有限公司);2xPCR TaqMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);瓊脂糖(上海貝晶生物技術(shù)有限公司);氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);PCR擴(kuò)增引物、DNA Marker(2000bp)、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.3 動(dòng)物模型制備

采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型[5]。將釣魚線經(jīng)75%乙醇消毒后制備線栓,并置于蒸餾水中備用。大鼠成功麻醉后,仰位固定于手術(shù)臺(tái)上。手術(shù)區(qū)域常規(guī)消毒,備皮后沿頸前正中線縱行切開皮膚,鈍性分離皮膚和皮下肌肉組織,在暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery, CCA)后,依次分離出頸外動(dòng)脈(external carotid artery, ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery, ICA),并時(shí)刻保護(hù)迷走神經(jīng)。依次在CCA近、遠(yuǎn)心兩端以及ECA掛線備用。隨后先用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA,并迅速結(jié)扎CCA近心端和ECA。在距離左側(cè)CCA分叉4 mm處剪一斜向小口,由此將線栓小心插入ICA中,先將CCA遠(yuǎn)端掛線稍系緊,然后繼續(xù)推進(jìn)栓線進(jìn)入ICA,在栓線過ICA的分叉18 mm時(shí),系緊CCA遠(yuǎn)心端的掛線。然后清理手術(shù)切口,用青霉素消炎處理,再逐層縫合肌肉和皮膚,用碘伏對(duì)切口表面進(jìn)行局部消毒。A組除不進(jìn)行插入線栓外,其余處理同B組。造模成功大鼠會(huì)出現(xiàn)明顯右肢癱瘓;或?qū)⑵涮嵛矐铱諘r(shí),出現(xiàn)右上肢屈曲或向左側(cè)傾斜、轉(zhuǎn)圈。

1.4 動(dòng)物干預(yù)方法

C組、D組和E組分別在造模成功后2 h、72 h和168 h進(jìn)行針刺治療。取左側(cè)百會(huì)及雙側(cè)風(fēng)池穴,穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]。將大鼠牢牢捆綁固定后,采用0.30 mm×13 mm毫針進(jìn)行針刺,百會(huì)向曲鬢穴透刺,進(jìn)針約0.8 mm,留針30 min,其間每隔10 min行捻轉(zhuǎn)手法1 min,要求速度為180～200 r/min;風(fēng)池進(jìn)針約0.5 mm,留針30 min,其間每隔10 min行提插捻轉(zhuǎn)手法1次。各針刺組均每日治療1次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定

各組分別于術(shù)后1 d、3 d、7 d及14 d隨機(jī)選擇10只大鼠,采用Garcia 18分的復(fù)合評(píng)分法[7]對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。

1.5.2 腦組織標(biāo)本采集及指標(biāo)的測(cè)定

在神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)試完成后,在相應(yīng)時(shí)間將大鼠處死并斷頭,分離缺血部分的腦組織備用。利用WB法檢測(cè)PTEN、p-AKT和p-GSK3b蛋白的表達(dá),利用RT-PCR法檢測(cè)PTEN、p-AKT和p-GSK3bmRNA的轉(zhuǎn)錄情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

各組在取材前共死亡45只,未進(jìn)行取材及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,總死亡率為18.4%。其中A組死亡1只,原因?yàn)檫M(jìn)行CCA切口時(shí)不慎將其剪斷,且近心端未結(jié)扎完全,導(dǎo)致大量出血死亡;B組死亡8只;C組死亡16只;D組死亡11只,E組死亡9只。造模時(shí)大鼠共死亡39只,造模成功率為80.9%,死亡原因?yàn)樾g(shù)中損傷迷走神經(jīng)導(dǎo)致呼吸心率衰竭、插入線栓時(shí)大量出血及術(shù)后感染等。此外,C組在造模后2 h進(jìn)行針刺治療,由于大鼠掙扎導(dǎo)致未完全愈合的傷口開裂,從而出血或感染死亡5只。進(jìn)行手術(shù)且存活的大鼠均單獨(dú)置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專用籠,保證供給足量且等量的飼料和水,盡可能保證影響因素一致,并按時(shí)清理墊料保持衛(wèi)生,以此避免感染及不必要的傷害。剩余5只大鼠妥善飼養(yǎng)。

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)Garcia復(fù)合評(píng)分比較

由表1可見,A組不存在神經(jīng)功能缺損,故4個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均為(18.00±0.00)分。C組和E組術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d Garcia復(fù)合評(píng)分與B組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。D組術(shù)后1 d Garcia復(fù)合評(píng)分與B組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。D組術(shù)后7 d和14 d Garcia復(fù)合評(píng)分與C組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d Garcia復(fù)合評(píng)分與C組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后3 d、14 d Garcia復(fù)合評(píng)分與D組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能明顯提高腦缺血中風(fēng)大鼠Garcia復(fù)合評(píng)分,改善其感覺、運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)功能,其中C組改善大鼠神經(jīng)功能效果最好。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)Garcia復(fù)合評(píng)分比較 (±s,分)

注:與B組比較1)＜0.01;與C組比較2)＜0.05;與D組比較3)＜0.05

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b蛋白表達(dá)比較

由圖1、表2可見,A組大鼠腦組織中PTEN蛋白呈低表達(dá);B組大鼠腦組織中PTEN蛋白呈高表達(dá),隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),并在缺血7 d時(shí)到達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中PTEN蛋白表達(dá)均有不同程度降低,隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng),降低越為顯著,其中以C組最為明顯。

B組、C組、D組和E組在不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN蛋白表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組、D組和E組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN蛋白表達(dá)與B組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。D組和E組術(shù)后3 d、7 d和14 d PTEN蛋白表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后14 d PTEN蛋白表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠降低缺血腦組織中PTEN蛋白表達(dá),且針刺干預(yù)越早對(duì)PTEN的影響越明顯。

由圖1、表3可見,A組大鼠腦組織中p-AKT蛋白呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-AKT蛋白呈低表達(dá),隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),并在缺血7 d時(shí)到達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-AKT蛋白表達(dá)均有不同程度升高,隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng),升高越為顯著,其中以C組最明顯。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中PTEN蛋白表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.05;與C組比較4)＜0.05;與D組比較5)＜0.05

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中p-AKT蛋白表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)P＜0.05

B組和C組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d) p-AKT蛋白表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.01,＜0.05)。C組和D組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT蛋白表達(dá)與B組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組術(shù)后3 d、7 d和14 d p-AKT蛋白表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d p-AKT蛋白表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-AKT蛋白表達(dá),針刺干預(yù)越早對(duì)p-AKT影響越明顯。

由圖1、表4可見,A組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白呈低表達(dá),隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),并在缺血7 d時(shí)到達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白表達(dá)均有不同程度升高,隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng),升高越為顯著,其中以C組最明顯。

B組、C組和D組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3b蛋白表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。C組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3b蛋白表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d p-GSK3b蛋白表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-GSK3b蛋白表達(dá),針刺干預(yù)越早對(duì)p-GSK3b的影響越明顯。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中p-GSK3b蛋白表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.01,3)＜0.05;與C組比較4)＜0.01,5)＜0.05;與D組比較6)＜0.05

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b轉(zhuǎn)錄比較

由圖2可見,A組大鼠腦組織中PTEN mRNA呈低轉(zhuǎn)錄;B組大鼠腦組織中PTEN mRNA呈高轉(zhuǎn)錄,隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),并在缺血7 d時(shí)達(dá)到高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中PTEN mRNA的轉(zhuǎn)錄情況均有不同程度的降低,隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng),降低越為顯著,其中以C組最明顯。

由表5可見,B組、C組、D組和E組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA表達(dá)與A組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d PTEN mRNA表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠有效抑制缺血腦組織中PTEN mRNA的轉(zhuǎn)錄,針刺干預(yù)越早對(duì)PTEN mRNA的影響越明顯。

由圖3可見,A組大鼠腦組織中p-AKT mRNA呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-AKT mRNA呈低表達(dá),隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),并在缺血7 d時(shí)達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-AKT mRNA表達(dá)均有不同程度的升高,隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng),升高越為顯著,其中以C組最明顯。

由表6可見,B組、D組和E組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT mRNA表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組術(shù)后1 d、7 d和14 d p-AKT mRNA表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。C組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT mRNA表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后7 d和14 d PTEN mRNA表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-AKT mRNA表達(dá),針刺干預(yù)越早對(duì)p-AKT mRNA的影響越明顯。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中PTEN mRNA表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術(shù)后1 d;2為A組術(shù)后3 d;3為A組術(shù)后7 d;4為A組術(shù)后14 d;5為B組術(shù)后1 d;6為B組術(shù)后3 d;7為B組術(shù)后7 d;8為B組術(shù)后14 d; 9為C組術(shù)后1 d;10為C組術(shù)后3 d;11為C組術(shù)后7 d;12為C組術(shù)后14 d;13為D組術(shù)后1 d;14為D組術(shù)后3 d;15為D組術(shù)后7 d;16為D組術(shù)后14 d;17為E組術(shù)后1 d;18為E組術(shù)后3 d;19為E組術(shù)后7 d;20為E組術(shù)后14 d

表6 各組大鼠缺血腦組織中p-AKT mRNA表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)＜0.01,8)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術(shù)后1 d;2為A組術(shù)后3 d;3為A組術(shù)后7 d;4為A組術(shù)后14 d;5為B組術(shù)后1 d;6為B組術(shù)后3 d;7為B組術(shù)后7 d;8為B組術(shù)后14 d; 9為C組術(shù)后1 d;10為C組術(shù)后3 d;11為C組術(shù)后7 d;12為C組術(shù)后14 d;13為D組術(shù)后1 d;14為D組術(shù)后3 d;15為D組術(shù)后7 d;16為D組術(shù)后14 d;17為E組術(shù)后1 d;18為E組術(shù)后3 d;19為E組術(shù)后7 d;20為E組術(shù)后14 d

由圖4可見,A組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA呈低表達(dá),隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),并在缺血7 d時(shí)達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA表達(dá)均有不同程度的升高,隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng),升高越為顯著,其中以C組最明顯。

由表7可見,B組、C組、D組和E組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3bmRNA表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3bmRNA表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后14 d p-GSK3bmRNA表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-GSK3bmRNA表達(dá),針刺干預(yù)越早對(duì)p-GSK3bmRNA的影響越明顯。

表7 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中p-GSK3b mRNA表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01;與D組比較6)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術(shù)后1 d;2為A組術(shù)后3 d;3為A組術(shù)后7 d;4為A組術(shù)后14 d;5為B組術(shù)后1 d;6為B組術(shù)后3 d;7為B組術(shù)后7 d;8為B組術(shù)后14 d; 9為C組術(shù)后1 d;10為C組術(shù)后3 d;11為C組術(shù)后7 d;12為C組術(shù)后14 d;13為D組術(shù)后1 d;14為D組術(shù)后3 d;15為D組術(shù)后7 d;16為D組術(shù)后14 d;17為E組術(shù)后1 d;18為E組術(shù)后3 d;19為E組術(shù)后7 d;20為E組術(shù)后14 d

3 討論

神經(jīng)功能評(píng)分是腦缺血中評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損害及神經(jīng)功能恢復(fù)程度的行為學(xué)檢查方法。目前,Garcia復(fù)合評(píng)分法從大鼠自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)活動(dòng)對(duì)稱性、前肢伸展功能、網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)、身體雙側(cè)感覺、雙側(cè)胡須反射6方面多角度評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損程度,可避免單一評(píng)價(jià)方法的片面及主觀性,且該方法可操作性好[5]。本研究對(duì)針刺后的腦缺血中風(fēng)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,證實(shí)針刺能明顯提高腦中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能Garcia復(fù)合評(píng)分,改善缺血性中風(fēng)大鼠的感覺、運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)功能,從而有效改善缺血型腦中風(fēng)大鼠的神經(jīng)功能。

本研究在對(duì)于腦缺血模型大鼠的針刺治療中遵循了中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)理論,并結(jié)合現(xiàn)代臨床研究,采用活血化瘀、醒腦開竅的治法,取頭部百會(huì)穴(透曲鬢穴)及風(fēng)池穴,此法在頭部貫穿督脈、膀胱經(jīng)、膽經(jīng)3條陽經(jīng),可通發(fā)陽氣,從而達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、行散瘀血的作用。針刺首先對(duì)還未凋亡的神經(jīng)細(xì)胞和未受累及的正常神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行雙向刺激,以此來抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞活性;其次,針刺還能改善局部血液循環(huán),提高缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性,這進(jìn)一步加強(qiáng)了腦代償功能,使神經(jīng)細(xì)胞功能迅速得到改善和保護(hù)[7-9]。

PTEN陽性表達(dá)產(chǎn)物具有磷酸酶活性[3],其在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在,尤其在大腦皮質(zhì)、杏仁核、尾殼核、小腦、海馬的表達(dá)較強(qiáng)[10]。腦缺血后,缺血部位細(xì)胞內(nèi)滲透迅速升高,嚴(yán)重打破細(xì)胞內(nèi)外離子平衡,使細(xì)胞水腫、壞死、凋亡,嚴(yán)重情況可直接導(dǎo)致細(xì)胞破裂。由此凋亡的細(xì)胞破裂后,向周圍細(xì)胞釋放化學(xué)信號(hào),使PTEN迅速升高表達(dá)[11],并調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路,通過減少磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3),抑制細(xì)胞增殖,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,缺血腦組織中PTEN蛋白和基因呈高表達(dá),不同針刺介入時(shí)機(jī)治療后,PTEN蛋白和基因表達(dá)均有不同程度的降低,其中以C組變化最為明顯。神經(jīng)元死亡形式主要有壞死和凋亡兩種,下調(diào)PTEN可阻斷鈣離子內(nèi)流[16],減少鈣離子超載引起的神經(jīng)元延遲性壞死,同時(shí)平衡細(xì)胞內(nèi)外離子水平,改善能量代謝,抑制缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡[1]。筆者推測(cè)針刺對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠腦損傷的保護(hù)機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)PTEN基因表達(dá)下調(diào),從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路,使p-AKT蛋白表達(dá)增加,抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

近年來相關(guān)研究表明,PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為促進(jìn)細(xì)胞生存關(guān)鍵信號(hào)通路已經(jīng)得到廣泛的證實(shí),對(duì)維持細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[3]。PI3K/AKT途徑的負(fù)性調(diào)控主要受具有雙重功能的類脂磷酸酶PTEN的調(diào)控,存在p-AKT參與促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的生理活動(dòng),尤其在組織缺血和缺氧的條件下,p-AKT的作用則更為重要[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同時(shí)間點(diǎn)腦缺血模型組p-AKT蛋白和基因表達(dá)明顯降低,不同針刺介入治療后較腦缺血組明顯增加,且神經(jīng)功能缺損減輕,腦組織病理損害減小,其中以C組最為明顯。不同針刺介入時(shí)機(jī)是通過PI3K/AKT通路的激活并增加磷酸化AKT的水平發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用。

GSK-3是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶,包括GSK-3a和GSK-3b兩種亞型,其中GSK-3b與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用GSK-3b抑制劑可以保護(hù)腦缺血中神經(jīng)細(xì)胞,減少腦梗死體積并且改善神經(jīng)功能缺失。磷酸化的GSK-3b能夠抑制GSK-3b的活性,參與神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)。有研究報(bào)道,缺氧預(yù)處理可以通過增加p-AKT的表達(dá)而增加p-GSK3b的表達(dá),從而對(duì)缺氧損傷的神經(jīng)元起到保護(hù)作用[21]。本實(shí)驗(yàn)中B組p-GSK3b蛋白和基因的表達(dá)明顯降低;不同針刺介入時(shí)機(jī)治療后能明顯增加p-GSK3b蛋白和基因的表達(dá),其中以C組最為明顯。針刺抑制GSK-3b活性可能通過提高體內(nèi)Mg2+濃度直接抑制GSK-3b的活性,同時(shí)通過增加AKT的磷酸化間接減少GSK-3b活性。

綜上所述,針刺能抑制缺血性中風(fēng)大鼠PTEN蛋白和基因的表達(dá),增強(qiáng)PI3K/AKT/GSK3b信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),這可以改善其缺血組織的能量代謝,調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),從而起到對(duì)腦缺血神經(jīng)元損傷的修復(fù)、再生和保護(hù)作用。而且造模后2 h針刺介入的效果明顯優(yōu)于72 h和168 h,故筆者推測(cè)針刺介入時(shí)機(jī)越早,對(duì)腦缺血神經(jīng)元損傷的修復(fù)、再生和保護(hù)作用越明顯。但由于實(shí)驗(yàn)條件和經(jīng)驗(yàn)限制,故尚不足以證明此推測(cè)成立。望廣大學(xué)者繼續(xù)努力研究,尋找出最佳時(shí)機(jī)。

[1] 周鑫,周亞軍,張懷波,等.針刺治療急性缺血性中風(fēng)的臨床實(shí)驗(yàn)分析[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2017,26(8):1358- 1360.

[2] 秦光成,謝景梅,劉春曉,等.PTEN下調(diào)表達(dá)對(duì)反復(fù)發(fā)作性偏頭痛大鼠模型行為學(xué)的影響[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2016,22(1):11-16.

[3] 崔曉萍,陳建梅,穆軍山,等.PTEN通過拮抗PI3K/Akt信號(hào)通路抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖[J].西安交通大學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,37(2):239-243.

[4] 劉小鶯,吳莉,陳洲,等.PTEN抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2016,32(4): 514-519.

[5] 閔鶴鳴,賈玉潔,姜興千,等.硫酸鎂對(duì)大鼠局灶性腦缺血后氧化應(yīng)激和NF-kB蛋白表達(dá)的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2016,33(7):588-591.

[6] 郭義.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2016: 133.

[7] 劉勇,王洪,趙軍,等.針刺介入時(shí)機(jī)對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2014,7(8):581-586.

[8] 劉勇,鄒偉,趙軍,等.針刺對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷和能量代謝的影響[J].針灸臨床雜志,2014,30(8): 64-67.

[9] 劉勇,趙軍,王洪,等.針刺介入時(shí)機(jī)對(duì)腦梗死大鼠能量代謝和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、酪氨酸激酶受體B的影響[J].中國(guó)臨床保健雜志,2014,17(4);376-380.

[10] 張金朋.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血區(qū)皮層RhoA、PTEN表達(dá)的影響[D].黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)碩士論文,2015:1-58.

[11] 趙婧,謝雪梅,陳玉蓉.腫瘤抑制因子PTEN亞細(xì)胞定位與缺血-缺氧性腦損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,36 (12):1718-1722.

[12] Arendt KL, Benoist M, Lario A,. PTEN counteracts PIP3 upregulation in spines during NMDA-receptor-dependent long-term depression[J]., 2014,127 (Pt 24):5253-5260.

[13] Chi H, Yang R, Zheng X,.LncRNA RP11-79H23.3 Functions as a Competing Endogenous RNA to Regulate PTEN Expression through Sponging hsa-miR-107 in the Development of Bladder Cancer [J]., 2018, 19(9):E2531.

[14] Xu W, Yang Z, Xie C,.PTEN lipid phosphatase inactivation links the hippo and PI3K/Akt pathways to induce gastric tumorigenesis[J]., 2018,37(1):198.

[15] Lin H, Huang ZP, Liu J,. MiR-494-3p promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and human hepatocellular carcinoma progression by targeting PTEN[J]., 2018,8(1):10461.

[16] Zhao J, Qu Y, Wu J,. PTEN inhibition prevents rat cortical neuron injury after hypoxia-ischemia[J]., 2013,238:242-251.

[17] Li W, Huang R, Chen Z,. PTEN degradation after ischemic stroke: a double-edged sword[J]., 2014,274:153-161.

[18] Di Y, Chen XL.Inhibition of LY294002 in retinal neovascularizationdown-regulation the PI3K/AKT- VEGF pathwayand[J]., 2018,11(8):1284-1289.

[19] Gao YY, Zhang ZH, Zhuang Z,. Recombinant milk fat globule-EGF factor-8 reduces apoptosis via integrin β3/FAK/PI3K/AKT signaling pathway in rats after traumatic brain injury[J]., 2018,9(9): 845.

[20] 陳勇,付貞,范林,等.PI3K/Akt信號(hào)通路在肝臟缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2018, 25(1):103-107.

[21] Mao LL, Hao DL, Mao XW,. Neuroprotective effects of bisperoxovanadium on cerebral ischemia by inflam- mation inhibition[J].urosci Lett, 2015,602:120-125.

Effect of Acupuncture Intervention Time on PTEN, p-AKT and p-GSK3bin Brain Tissues of Rats with Ischemic Stroke

1,-2.

1.,,150040,; 2.,150040,

To investigate the effects of different intervention times on phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10 (PTEN), phosphorylated protein kinase B (p-AKT) and glycogen synthase kinase-3b(p-GSK3b) in brain tissue of rats with ischemic stroke.Two hundred adult male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized to group A (sham operation group ), group B (model group), group C (group of acupuncture at 2 h after modeling), group D (group of acupuncture at 72 h after modeling) and group E (group of acupuncture at 168 h after modeling), with 40 rats in each group. Except group A, the rats of all the other groups were prepared into permanent focal cerebral ischemia model by suture-occluded method. Respectively, 1, 3, 7 and 14 days after surgery, Garcia composite score method was used to evaluate the neural function of the rats. Transcription of PTEN, p-AKT and p-GSK3bgene and the expression of their proteins in brain tissues of rats were examined by Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method.Compared with group B, Garcia composite score increased significantly (＜0.01) at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group C and group E. Garcia composite score at different time points (7 and 14 days after surgery) in group D were significantly different from that in group C (＜0.05). Garcia composite score at different time points (3, 7 and 14 days after surgery) in group E were significantly different from that in group C (＜0.05). The expressions of PTEN, p-AKT and p-GSK3bproteins and the expression of PTEN mRNA, p-AKT mRNA and p-GSK3bmRNA at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group B were significantly different from those in group A and group C (＜0.01,＜0.05). The expressions of PTEN, p-AKT and p-GSK3bproteins at different time points (3, 7 and 14 days after surgery) in group D and group E were significantly different from those in group C (＜0.01,＜0.05). The expressions of PTEN mRNA, p-AKT mRNA and p-GSK3bmRNA at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group D and group E were significantly different from those in group C (＜0.01,＜0.05).Acupuncture can significantlydown-regulate the expression of PTEN in the neurons of ischemic brain tissues, and significantly increase the expressions of p-AKT and p-GSK3b, through which it can suppress neural cell apoptosis, protect and repair the damaged neurons. The sooner the intervention of acupuncture, the better the treatment effect.

Acupuncture; Cerebral infarction; Intervention time; Stroke; Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10; Phosphorylated Protein Kinase B; Glycogen synthase kinase-3b; Rats

1005-0957(2018)09-1068-08

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.09.1068

2018-04-18

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2016061);黑龍江省博士后資助項(xiàng)目(LBH-Z11011)

劉勇(1975—),女,副主任醫(yī)師,博士,Email:24680190@qq.com