汪巍巍，李明忠

(蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 215123)

柞蠶絲是野蠶絲中常見的品種，在我國柞蠶絲有較大的產(chǎn)量。柞蠶絲素蛋白(ASF)具有生物相容性好，可生物降解等優(yōu)點，近年來受到極大的關(guān)注[1-3]。柞蠶絲素蛋白分子含有豐富的化學反應(yīng)位點[4-5]，為改性柞蠶絲素蛋白提供了可能。大量研究表明柞蠶絲素蛋白含有較多的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列，它能與多種細胞表面大量表達的αvβ3和αvβ5整合素受體靶向結(jié)合[6]。因此，柞蠶絲素蛋白用作生物醫(yī)學材料的研究和開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

聚乙烯亞胺(PEI)是一種陽離子聚合物，目前廣泛用作基因傳遞載體[7-8]。利用高分子量PEI(分子量：25 kDa)作為基因傳遞載體，雖然基因轉(zhuǎn)染效率較高，但存在細胞毒性較大，不易被降解等缺點[9]。相比之下，低子量PEI的細胞毒性比較小。將分子量為1 800 Da的PEI接枝到牛血清蛋白上，得到的陽離子化牛血清蛋白(CBSA)能夠有效地將DNA包裹和壓縮成50～200 nm微球，體外細胞轉(zhuǎn)染實驗表明，CBSA/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率與 25 kDa PEI相當，同時表現(xiàn)出較低的細胞毒性[10]。

柞蠶絲素蛋白在中性環(huán)境下帶負電荷，不能直接用于包被、壓縮核酸質(zhì)粒[11]。若要賦予柞蠶絲素蛋白包被、壓縮核酸質(zhì)粒的能力，從而用作基因傳遞載體，則需使其表面帶大量的正電荷。在我們的前期研究中[12]，曾用精胺對柞蠶絲素蛋白進行陽離子化改性，但由于精胺所帶氨基較少，當精胺加入量為6 %時，改性后柞蠶絲素蛋白溶液Zeta電位僅為 +8.4 mV左右。用低分子量PEI改性柞蠶絲素蛋白，有望使柞蠶絲素蛋白表面帶更多的正電荷，更好地達到包被、壓縮核酸質(zhì)粒的作用。本文用碳化二亞胺(EDC)介導(dǎo)柞蠶絲素蛋白側(cè)鏈上的羧基與低分子量(1 800 Da)PEI上氨基的反應(yīng)，將PEI接枝于柞蠶絲素蛋白的側(cè)鏈，使柞蠶絲素蛋白表面帶上大量正電荷，從而獲得經(jīng)PEI改性的陽離子化柞蠶絲素(CASF)。

1 材料與方法

1.1 低分子量聚乙烯亞胺對柞蠶絲素蛋白的改性

首先按照文獻報道的方法，制備柞蠶絲素蛋白溶液[12]。然后將50 mL柞蠶絲素蛋白溶液(10 mg/ mL)分別裝入8個燒杯中，加入占柞蠶絲素蛋白質(zhì)量0、0.1%、0.5%、1%、2%、4%、6%和8%的PEI(10 mg/mL)；使用HCl溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)其pH值至7.5～8.0；隨后加入EDC，其質(zhì)量為柞蠶絲素蛋白質(zhì)量的20%；冰浴條件下反應(yīng)過夜；在 4 ℃條件下用去離子水透析4 d；透析完畢后， 5 000 r/min離心30 min，取上清溶液，獲得改性后柞蠶絲素蛋白溶液。

1.2 Zeta電位測試

取適量柞蠶絲素蛋白溶液和改性后柞蠶絲素蛋白溶液裝入Zeta電位槽中，用馬爾文粒徑電位分析儀(Malvern Nano-ZS90)測定Zeta電位，測試重復(fù)次數(shù)設(shè)為3。

1.3 X-射線光電子能譜測試

將20 mL柞蠶絲素蛋白溶液和改性后柞蠶絲素蛋白溶液分別冷凍、干燥，再將樣品剪成微細顆粒，用150目篩網(wǎng)篩下顆粒，壓片制樣，用X-射線光電子能譜儀(Axis Ultra HAS)分析樣品表面的化學組成。

1.4 圓二色光譜測試

稀釋柞蠶絲素蛋白溶液和改性后柞蠶絲素蛋白溶液分別至1 mg/mL，取3 mL加入到石英比色皿中，用圓二色光譜儀(Model410AVIV)室溫檢測190～250 nm波長范圍內(nèi)樣品的摩爾橢圓度，分析經(jīng)PEI改性對柞蠶絲素蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.5 核磁共振氫譜測試

室溫下，用500 μL重水溶解冷凍干燥后的柞蠶絲素蛋白、改性后柞蠶絲素蛋白及PEI(約5 mg)，再裝入干凈的核磁管，用核磁共振儀(Bruker AV300-MHz NMR)進行核磁共振氫譜測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 柞蠶絲素蛋白與PEI的反應(yīng)原理

圖1 PEI改性柞蠶絲素蛋白的反應(yīng)原理示意圖

低分子量PEI陽離子化改性柞蠶絲素蛋白的反應(yīng)原理，如圖1所示。中性條件下，柞蠶絲素蛋白大分子的天門冬氨酸和谷氨酸側(cè)鏈上的羧基(-COOH)基團容易失去H+，電離成―COO-，使柞蠶絲素蛋白表面帶負電荷。柞蠶絲素蛋白側(cè)鏈上羧基與碳化二亞胺上的碳氮雙鍵(-N=C-)反應(yīng)，形成O-異酰脲衍生物。不穩(wěn)定的O-異酰脲衍生物再與PEI上的伯氨基反應(yīng)，形成新的酰胺鍵。最終，改性后的柞蠶絲素蛋白帶有大量的氨基，使其表面帶上正電荷。

2.2 改性后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位

圖2 PEI改性后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位

經(jīng)低分子量PEI改性前后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位如圖2所示，柞蠶絲素蛋白的Zeta電位為-7.24±0.38 mV。隨著PEI加入量的增加，改性后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位呈現(xiàn)先增大后略有減小的趨勢。用占絲素蛋白質(zhì)量0.5%的PEI進行改性，改性后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位從負值翻轉(zhuǎn)為正值(+1.37±0.54 mV)，表明經(jīng)PEI改性后柞蠶絲素蛋白的表面帶上正電荷。用占絲素蛋白質(zhì)量4%的PEI進行改性，改性后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位達到+11.4±0.22 mV。之后，隨著PEI加入量的增加，改性后柞蠶絲素蛋白的Zeta電位略有減小，表明反應(yīng)可能接近飽和狀態(tài)。因此，可用占柞蠶絲素蛋白質(zhì)量4%的PEI對柞蠶絲素蛋白進行改性，并進行后續(xù)實驗研究。

2.3 改性后柞蠶絲素蛋白的X-射線光電子能譜

(a)柞蠶絲素，(b)改性后柞蠶絲素圖3 PEI改性后柞蠶絲素蛋白的X-射線光電子能譜

表1 PEI改性后柞蠶絲素蛋白的元素分析表

圖3為經(jīng)PEI改性前后的柞蠶絲素蛋白的表面元素含量變化，表1為經(jīng)PEI改性后柞蠶絲素蛋白的元素分析表。與改性前柞蠶絲素蛋白相比，經(jīng)PEI改性后柞蠶絲素蛋白的O/C元素比由0.41減小到0.36。柞蠶絲素蛋白側(cè)鏈上的羧基(-COOH)基團與PEI上的氨基形成新的酰胺鍵消耗O元素，因此O/C元素比減小。而N/C元素比由0.29增大到0.33，因為PEI(NH2-R-NH2)是一種陽離子聚合物，含有大量氨基，N元素含量較高。絲素蛋白表面元素的變化說明，PEI有效地與柞蠶絲素蛋白發(fā)生了反應(yīng)。

2.4 改性后柞蠶絲素蛋白的圓二色光譜

(a)柞蠶絲素，(b)改性后柞蠶絲素 圖4 PEI改性后柞蠶絲素蛋白的圓二色光譜

本文用圓二色光譜儀檢測改性前后柞蠶絲素蛋白分子構(gòu)象的變化。由圖4可知，改性前柞蠶絲素溶液在207 nm和221 nm附近都有較強的負峰出現(xiàn)，如圖4(a)，這兩處負峰為α-螺旋的特征峰[13]，說明柞蠶絲素蛋白溶液分子構(gòu)象以α-螺旋為主，含少量無規(guī)卷曲。由圖4(b)可見，改性后柞蠶絲素蛋白在198 nm附近出現(xiàn)正峰，而同時在218 nm附近出現(xiàn)負寬峰，這兩處均屬于β-折疊的特征峰[13]。由此可以看出，經(jīng)PEI改性后柞蠶絲素蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生了由α-螺旋和/或無規(guī)卷曲向β-折疊的顯著轉(zhuǎn)變。

2.5 改性后柞蠶絲素蛋白的1H-NMR譜

圖5 PEI改性后柞蠶絲素蛋白的1H-NMR譜

通過1H-NMR檢測改性前后柞蠶絲素蛋白氫核的化學位移來推測PEI與ASF是否成功偶聯(lián)。圖5中PEI的1H-NMR譜上，化學位移在a(～2.65×10-6)處為-NHCH2CH2-共振吸收峰，與文獻[14]的測定結(jié)果一致。在ASF的1H-NMR譜上，化學位移在b(～1.4×10-6)處的單峰為丙氨酸(Ala)上氫的共振吸收峰，化學位移在c(～3.8×10-6)處的單峰為纈氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)上氫的共振吸收峰，化學位移在d(～3.2×10-6)處的多重峰為天門冬氨酸(Asp)上氫的共振吸收峰，化學位移在e(～4.2×10-6)處的單峰為丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Ser)上氫的共振吸收峰[15]。觀察陽離子化柞蠶絲素(CASF)的1H-NMR譜，所有ASF的特征共振吸收峰在CASF的1H-NMR譜上均有出現(xiàn)。并且在CASF的1H-NMR譜上，化學位移在 f(～3.25×10-6)處出現(xiàn)了微弱的新峰，它是-CONHCH2CH2NH-結(jié)構(gòu)中緊鄰酰胺鍵的亞甲基質(zhì)子峰[16]，說明柞蠶絲素蛋白上的-COOH與PEI上的-NH2發(fā)生了反應(yīng)，生成了新的酰胺鍵。在CASF的1H-NMR譜上，PEI中未參加反應(yīng)的基團(2.4～2.7×10-6)保留了下來，同時發(fā)生了偏移[17]。

3結(jié)論

在碳化二亞胺的介導(dǎo)下，用低分子量聚乙烯亞胺改性柞蠶絲素蛋白。當PEI占柞蠶絲素蛋白質(zhì)量4%時，改性后柞蠶絲素蛋白的表面Zeta電位為+11.4±0.22 mV。X-射線光電子能譜測試結(jié)果表明，經(jīng)PEI改性后柞蠶絲素蛋白的O/C元素比減小，而N/C元素比增大。圓二色光譜分析顯示經(jīng)PEI改性后柞蠶絲素蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生了明顯轉(zhuǎn)變。1H-NMR 測試結(jié)果分析表明，PEI與柞蠶絲素蛋白反應(yīng)后生成新的酰胺鍵。上述結(jié)果說明，在碳化二亞胺的介導(dǎo)下，PEI上的氨基可與柞蠶絲素蛋白側(cè)鏈上的羧基反應(yīng)，使得柞蠶絲素蛋白表面的電荷由負電荷翻轉(zhuǎn)為正電荷，從而制得陽離子化柞蠶絲素。低分子量聚乙烯亞胺改性的柞蠶絲素蛋白具有作為一種新基因傳遞載體的可能。