胡 敏，歐陽軍，胡 蓉，杜華英，羅秋水，熊建華*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省安遠(yuǎn)縣果然食品有限公司，江西 安遠(yuǎn) 342100)

色素賦予食品繽紛的色澤韻味，給人以美的享受和味道的聯(lián)想，現(xiàn)代食品工業(yè)使用的色素基本上都是合成色素，合成色素主要以煤焦油中分離的苯胺為原料加工制成，有不同程度的危害作用，情況嚴(yán)重可致癌、致畸、致突變，因此天然色素的獲取和使用越來越受到人們的關(guān)注[1-2]。

花青素(anthocyanidin),又稱花色素，是一種天然的水溶性色素，具有抗氧化，抗突變，抗腫瘤，抗疲勞，治療心腦血管疾病等多種生理作用[3-4]。天然花青素雖在甘薯、葡萄、藍(lán)莓、茄子等食物中廣泛存在，但由于含量較低且食物價格較高等原因，至今在我國開發(fā)利用的相對較少，不能滿足市場的需求[5]。百香果(PassifloraeduliaSims)，又名雞蛋果，在氣候溫暖的海南、廣西、江西贛州等地區(qū)具有較好的適應(yīng)性[6-8]，產(chǎn)量正在逐年提高，百香果的消費主要以鮮果和果汁形式，產(chǎn)地及果汁加工廠有大量百香果果皮廢棄物，百香果外果皮富含花青素[9]，本試驗以紫果百香果為原料研究其外果皮中花青素的提取工藝及穩(wěn)定性，為百香果資源的開發(fā)利用和天然花青素的獲取、應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

試驗材料：百香果紫香一號，江西果然食品有限公司提供。選擇成熟、色澤紫紅的百香果果皮，洗凈晾干，剔除內(nèi)果皮得到堅硬的外果皮，冷凍干燥，打成粉，過40目篩，干燥器中保藏，備用。

主要試劑：無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、山梨酸、苯甲酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：紫外-可見分光光度計(SPECORD 200)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000)，德國耶拿分析儀器股份公司；恒溫水浴鍋(HH-4)，國華電器有限公司；冷凍干燥機(jī)(FD-1D-50)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；超低溫冰箱(902-ULTS)，美國賽默飛。

1.2 試驗方法

1.2.1 百香果外果皮中花青素的提取及測定 稱取1 g百香果外果皮粉末樣品，加入一定料液比的乙醇溶液，回流提取一定時間，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，取一定濃縮液，用緩沖溶液稀釋后測定吸光度A[10]，根據(jù)公式(1)、(2)計算花青素的提取率。

溶液花色苷含量(mg/L)=A×MW×DF×1000/ε×1

(1)

花色苷提取率(mg/g)=C×V/m

(2)

式(1)中，A為吸光度；MW為花色苷相對分子質(zhì)量(465)；DF為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)(35 481)；1為比色皿光程(1 cm)，以 3′甲花翠素-3-葡萄糖苷計；式(2)中，C為溶液花色苷質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為溶液體積(mL)；m表示百香果果殼質(zhì)量(g)。

1.2.2 單因素試驗 選擇單因素試驗因素及水平范圍為pH 1～6，料液比1∶15～1∶40，提取時間1～6 h，提取溫度10～60 ℃和乙醇濃度40%～90%。探究百香果外果皮中花青素的最佳單因素提取條件。

1.2.3 提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法[11]，優(yōu)化百香果外果皮花青素的提取工藝。根據(jù)單因素的結(jié)果分析，選擇提取pH為2，以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度為響應(yīng)變量因子，以A、B、C、D表示。試驗因素和水平編碼設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表

1.2.4 花青素穩(wěn)定性研究 將花青素提取液置于不同光線、不同溫度、不同pH環(huán)境中，或添加氧化劑、還原劑、防腐劑、漂白劑、護(hù)色劑、不同離子進(jìn)行穩(wěn)定性測定，每隔一定時間測其吸收光譜，觀察吸收度和最大吸收波長的變化，每組試驗重復(fù)3次并與相應(yīng)的空白進(jìn)行比較對照。所有添加劑的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)與添加劑量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對百香果外果皮花青素提取效果的影響結(jié)果

由圖1a可知，花青素在510～530 nm波長范圍內(nèi)均有吸收，且提取效果受pH的影響較大，當(dāng)樣品提取液pH為1、2時，花青素吸光度較強，提取效果較好，pH為3、4、5時，色素溶液吸光度降低較多，提取效果降低，在扣除基線的影響下，pH=1時，提取花青素效果最好，提取率為2.881 mg/g，但pH=1的酸性太強，花青素天然結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，pH=2時，提取率為2.877 mg/g，兩者提取效果相差不大，結(jié)合實際情況選擇pH=2為最佳提取酸度。由圖1b可知，當(dāng)乙醇濃度為80%～90%時，百香果果殼花青素提取率基本穩(wěn)定。由圖1c可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，花青素提取率不斷增大，當(dāng)溫度超過30 ℃時，提取率隨溫度的升高反而呈下降趨勢，可能因為溫度過高會使花青素的穩(wěn)定性受到影響，結(jié)構(gòu)改變所致，因此最佳提取溫度為30 ℃左右。由圖1d可知，在一定的條件下，隨著時間增加，百香果外果皮花青素提取率隨之增加，當(dāng)時間為4 h時，提取率到達(dá)最大，之后提取率降低，可能是由于長時間加熱使色素氧化所致，因此選取4 h為最佳提取時間。由圖1e可知，隨著料液比的增加，百香果外果皮中物質(zhì)在溶劑中溶解量增加，提取率不斷增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時，溶質(zhì)在溶劑的溶解達(dá)到飽和[12]，提取率達(dá)到最大值2.985 mg/g，因此最佳料液比1∶25。

圖1 pH、乙醇濃度、溫度、時間、料液比對百香果外果皮花青素的提取率的影響Fig.1 Effects of pH,ethanol concentration,temperature,time,and solid-to-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanidin in passion fruit outer skin

2.2 響應(yīng)面試驗分析

按照單因素試驗，選擇提取pH為2，采取4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計，以料液比Z1=(A-25)/5，提取溫度Z2=(B-30)/10，提取時間Z3=(C-4)/1，乙醇濃度Z4=(D-80)/10為自變量，以百香果外果皮中花青素提取率Y為響應(yīng)值，對提取花青素的工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗方案及結(jié)果如表2。

采用Design Expert 8.0.6軟件對百香果外果皮中色素提取的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到擬合方程：Y=3.05+0.043Z1+0.081Z2-0.031Z3+0.060Z4+0.050Z1Z2-0.13Z1Z3+ 0.030Z1Z4-0.094Z2Z3+0.020Z2Z4+0.040Z3Z4-0.20Z12-0.16Z22-0.18Z32-0.15Z42。回歸方差分析見表3。

表2 試驗方案及結(jié)果

由表3分析可知，該回歸方程的一次項和二次項影響極顯著，表明該模型不是簡單的線性關(guān)系，是二次拋物線的關(guān)系[13]，交互項Z2Z4不顯著，說明兩者之間相互影響不大，其余交互項顯著或極顯著，表明相互之間影響極大。各因素對花青素提取效果影響的顯著性與花青素易氧化的優(yōu)越抗氧化性能相吻合，由F值可知，影響百香果外果皮花素提取率由大到小的順序依次是提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時間。

整體模型P<0.01，表明該二次方程模型極顯著。R2為0.991 2，說明該模型響應(yīng)值的變化99.12%來自所選因變量，因此，該試驗方法能較好地反應(yīng)試驗結(jié)果的可行性，失擬項P>0.05不顯著，說明該模型擬合性好，可對最佳提取條件進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)Box-Behnken軟件分析得到百香果外果皮花青素最佳提取條件：料液比1∶26.28，溫度33.84 ℃，時間3.74 h，乙醇濃度82.18%。考慮到試驗操作條件更可行，將花青素最佳工藝調(diào)整為：料液比1∶26，提取溫度34 ℃，提取時間3.8 h，乙醇濃度82%。

響應(yīng)值對各單因素所組成的三維圖，即為響應(yīng)面圖，按照二次回歸方程，作出響應(yīng)面曲面圖和等高圖(圖2A～F)，等高線形狀反映出交互作用的顯著差異性。圖2E等高線幾乎接近圓形，表明溫度與乙醇濃度交互作用不顯著，圖2A～D、圖2F等高線圖形為橢圓形，表明相互之間交互作用顯著，與表3結(jié)果相符。

表3 回歸分析結(jié)果

A:(料液比和溫度)響應(yīng)面圖和等高圖 A:Interaction and solid-liquid ratio and temperature response surface and contour map

B:(料液比和時間)響應(yīng)面圖和等高圖B:The material liquid ratio and time interaction response surface and contour map

C:(料液比和乙醇濃度)響應(yīng)面圖和等高圖C:The material liquid ratio and ethanol concentration interaction response surface and contour map

D:(溫度和時間)響應(yīng)面圖和等高圖D:Temperature and time interaction response surface and contour map

E:(溫度和乙醇濃度)響應(yīng)面圖和等高線圖E:The response surface temperature and ethanol concentration interaction diagram and contour map

F:(時間和乙醇濃度)響應(yīng)面圖和等高線圖F:Time and ethanol concentration interaction response surface and contour map圖2 各兩因素交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects of solid-liquid ratio，temperature,ethanol concentration and time on the anthocyanin extraction rate from passion fruit

2.3 百香果外果皮中花青素最佳提取工藝的確定和驗證

在選定的優(yōu)化條件下，對花青素的提取進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果如表4，花青素實際提取率為3.125 mg/g，與預(yù)測提取率3.080 mg/g相對誤差僅為1.402%，因此，該提取工藝穩(wěn)定，可用于實際操作。

表4 驗證實驗結(jié)果(n=3)

2.4 穩(wěn)定性影響結(jié)果

2.4.1 光照對花青素穩(wěn)定性影響分析 由下列圖3a、圖3b、圖3c可知，不同的光照對花青素影響不同，室內(nèi)和避光時影響較小，吸光度隨著光照天數(shù)增加略微下降，在室外(11月份)太陽光下花青素吸光度下降較快，第6天吸光度下降了15%，第12天時下降了91%，吸收峰基本消失。所以太陽光對花青素穩(wěn)定性影響很大，保存時應(yīng)盡量避免強光的直射。

圖3 不同環(huán)境對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of different environments on the stability of anthocyanins

2.4.2 溫度對花青素穩(wěn)定性影響分析 由圖3d、表5可知，在50～100 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度升高，花青素的最大吸光度下降的速度越快，至200 ℃時吸光度大幅度下降，最大吸收波長甚至產(chǎn)生紅移，所以色素在高溫條件下穩(wěn)定性較差，結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生改變，使用該色素應(yīng)該避免高溫加熱工藝和高溫儲藏。

2.4.3 氧化劑和還原劑對花青素穩(wěn)定性的影響分析 由圖4、5，表6可知，加入Vc后體系的吸光度降低，而且隨著放置時間的延長，吸光度降低的越多；體系隨濃度的增加，吸光度值下降越快，濃度為0.2%時，Vc的吸光度降低了19%左右，濃度為1.0%時，吸光度降低了23%左右，濃度為2.0%時，吸光度降低了25%左右。H2O2對花青素的消色效果相較Vc更大，最終最大吸收峰會消失，且H2O2的濃度越大，吸收峰消失時間就越短，0.2%H2O2吸收峰消失耗時6 h，1.0%H2O2吸收峰消失耗時3 h，2.0%H2O2吸收峰消失耗時2 h。因此，儲存和使用花青素時，應(yīng)該盡量避免接觸還原劑或氧化劑，尤其是氧化劑。

表5 溫度對花青素穩(wěn)定性的影響

圖4 Vc對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of Vc on the stability of anthocyanin

圖5 H2O2 濃度對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of H2O2 on the stability of anthocyanin

時間/h TimeVc0.2%1.0%2.0%H2O20.2%1.0%2.0%00.624 70.624 70.624 70.624 70.624 70.624 710.484 60.513 20.521 90.385 00.167 70.261 020.505 70.500 90.511 50.298 40.265 80.261 830.505 70.478 80.466 60.231 10.258 10.256 4

2.4.4 防腐劑對花青素的穩(wěn)定性影響分析 由圖6可知，山梨酸鉀和苯甲酸鈉對花青素的影響很小，即使是用不同濃度的山梨酸鉀和苯甲酸鈉對色素溶液也幾乎是無任何影響。

圖6 防腐劑對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of preservatives on the stability of anthocyanins

圖7 漂白劑對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of bleaching agents on the stability of anthocyanins

2.4.5 漂白劑對花青素的穩(wěn)定性影響分析 由圖7可知，NaHSO3對花青素溶液有減色效應(yīng)。減色效果是隨NaHSO3的濃度增加而越明顯，加入0.1%NaHSO3后，吸光度的波峰已經(jīng)消失，故花青素溶液應(yīng)避免與漂白劑NaHSO3接觸。

2.4.6 發(fā)色劑對花青素穩(wěn)定性影響分析 由圖8可知，NaNO2對色素溶液有減色效應(yīng)，減色效果由大到小依次為：0.50% NaNO2、0.25% NaNO2、0.10% NaNO2和0.05% NaNO2，色素溶液中加入NaNO2后，溶液的最大吸收波長消失。色素濃液的顏色也逐漸由鮮紅色慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色濃液，所以NaNO2對色素溶液影響很大，要避免色素溶液和NO2-接觸。

2.4.7 pH對花青素的穩(wěn)定性影響分析 將提取的花青素溶液至不同pH并掃描其吸光度，由圖9可以看出，花青素溶液穩(wěn)定性隨pH值的變化趨勢與提取時一致，由于花青素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨pH值增大吸光度下降，并且在酸性環(huán)境中呈亮紅色，pH接近5時，漸有藍(lán)色摻入，最大吸光波長紅移，因此，花青素比較適用于酸性食品中。

圖8 發(fā)色劑對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of color fixative on pigment stability

圖9 pH對花青素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on the stability of anthocyanin

2.4.8 不同金屬離子對花青素的穩(wěn)定性影響分析 由表7可以看出，Al3 +、Fe3 +、Fe2+、Cu2 +對花青素溶液有增色效果，其中Al3 +的增色效果最為明顯；Fe3 +增色效果其次，隨著Fe3 +濃度的增加，吸光度增加，但最后花青素溶液會因為高濃度Fe3 +產(chǎn)生沉淀；再次是Fe2+、Cu2+濃度較低時增色效果不明顯，濃度較大時，對花青素的溶液有增色作用； 不同濃度Ca2 +、Mg2 +、Na+、K+對花青素溶液的穩(wěn)定性基本無影響，故該花青素溶液應(yīng)該避免與鐵制品、鋁制品、銅制品接觸。

表7 不同金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié) 論

本試驗以紫果百香果外果皮為原料，乙醇溶液為提取劑，通過采用單因素初篩和Box-Behnken優(yōu)化試驗，得出回歸方程：Y=3.05+0.043Z1+0.081Z2-0.031Z3+0.060Z4+0.050Z1Z2-0.13Z1Z3+0.030Z1Z4-0.094Z2Z3+0.020Z2Z4+0.040Z3Z4-0.20Z12-0.16Z22-0.18Z32-0.15Z42，一次項和二次項影響極顯著，交互項Z2Z4不顯著，其余顯著，說明該方程為二次拋物線。pH=2，料液比1∶26，溫度34 ℃，時間3.8 h和乙醇濃度82%為最佳提取條件。

百香果外果皮花青素的耐強光和高溫能力較差，200 ℃時最大吸收波長甚至產(chǎn)生紅移現(xiàn)象；NaHSO3、NaNO2、還原劑Vc和氧化劑H2O2對色素溶液有消色作用，NaHSO3、NaNO2能使色素溶液完全消色，還原劑Vc和氧化劑H2O2使色素溶液部分消色；Al3 +、Fe3 +、Fe2+、Cu2 +對色素有增色作用，Al3 +增色作用最強，而Fe3 +其次，高濃度時甚至產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，F(xiàn)e2+再次，Cu2 +只有濃度較大時才會有較明顯的增色作用，金屬離子Na+、K+、Mg2 +、Ca2 +對花青素影響不大；pH值對花青素影響較大，pH在1、2、3、4的花青素溶液是呈鮮亮的紅色，pH接近5時，色素溶液開始由亮紅漸變?yōu)樗{(lán)綠色；不同濃度的防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉對色素溶液幾乎是無任何影響。研究結(jié)果表明，天然百香果花青素穩(wěn)定性較差，可受到較多因素的影響，作為著色劑應(yīng)用到食品、醫(yī)藥及保健品等產(chǎn)品中應(yīng)注意使用和保存條件。