李永蓮, 陽元娥, 黎妍文, 劉文鋒

(1.廣東輕工職業(yè)技術學院 a.生態(tài)環(huán)境技術學院; b.食品與生物技術學院, 廣東 廣州 510300；2.五邑大學 化學與環(huán)境工程學院，廣東 江門 529020)

玉米不僅是全世界總產量最高的糧食作物，還是動物重要的飼料來源。玉米發(fā)源于墨西哥，在全球范圍內廣泛分布，是深受人們喜愛的主要食物之一。玉米芯作為玉米經食用后留下的農業(yè)廢棄物，長期得不到廣泛利用，既造成環(huán)境污染，又帶來極大的經濟損失。玉米芯主要成分包括纖維素、半纖維素、木質素等，因此再利用價值高。目前國內外利用玉米芯生產燃料乙醇、生物柴油等生物能源，既可解決玉米芯的處置問題，又符合社會可持續(xù)發(fā)展要求。 但是纖維素和半纖維素因被木質素包裹，且纖維素的結晶結構對生物降解具有一定的抑制作用[1]，從而難以被降解。如果對纖維素和半纖維素直接進行糖化，水解得率相當低，難以實現直接生物轉化。因此，在玉米芯發(fā)酵之前需進行預處理，即將固相中微生物可利用的有機質轉移到液相中，破壞木質素的包裹作用，降低玉米芯纖維素的結晶程度，增加葡萄糖的含量，提高玉米芯的發(fā)酵效率。

為了增強玉米芯后續(xù)發(fā)酵效果，本文以玉米芯為原料，采用蒸餾水、稀酸、堿、酶等10種不同預處理方法分別對玉米芯進行預處理，測定預處理后水解液中葡萄糖的含量，采用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)觀察預處理后玉米芯的纖維結晶結構變化，采用掃描電鏡(SEM)觀察預處理后玉米芯的纖維表面形態(tài)變化，以期找到一種經濟且適于工業(yè)化生產的玉米芯的預處理方法。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

玉米芯，購自廣西桂林，粉碎后過60目篩，置于75 ℃烘箱烘至恒重，然而置于樣品袋干燥保存；纖維素酶和半纖維素酶，購自諾維信(中國)投資有限公司；微生物菌，由廣東工業(yè)大學天然藥物與綠色化學研究所篩選培養(yǎng)所得；菌種液體培養(yǎng)基(PDA 培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂16 g、水1 000 mL。

1.2 實驗儀器

所選實驗儀器為電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司生產)、KDC-16H 高速離心機(中佳公司生產)、立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設備廠生產)、微量移液器(上海聯圣實驗儀器廠生產)、T-6 紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司生產)、Quanta 400F 熱場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡(荷蘭飛利浦 FEI公司生產)、TENSOR 37型傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司生產)。

1.3 實驗方法

(1) 玉米芯的蒸餾水預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，設計 2 個重復實驗，在濕熱高壓滅菌鍋中于 120 ℃預處理1 h。

(2) 玉米芯的1.0%H2SO4預處理，稱取玉米芯 10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL 1.0%稀H2SO4，設計2 個重復實驗，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預處理1 h。

(3) 玉米芯的1.0%NaOH預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL 1.0%NaOH，設計2個重復實驗，在濕熱高壓滅菌鍋中于25 ℃預處理0.5 h。

(4) 玉米芯的微生物預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入30 mL微生物，設計2個重復實驗，置于35 ℃、100 rad/min恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。

(5) 玉米芯的纖維素酶預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，利用NaOH稀溶液調節(jié)液體pH值至5.5，加入纖維素酶1 mL，設計2個重復實驗，置于恒溫搖床，在40 ℃、100 rad/min條件下培養(yǎng) 48 h[2]。

(6) 玉米芯的半纖維素酶預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，利用NaOH稀溶液調節(jié)液體pH值至4.8，加入半纖維素酶0.1 mL，設計2個重復實驗，置于恒溫搖床，在40 ℃、100 rad/min條件下培養(yǎng)48 h[2]。

(7) 玉米芯的半纖維素酶協同纖維素酶預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，利用NaOH稀溶液調節(jié)液體pH值至5.0，加入纖維素酶1 mL、半纖維素酶0.1 mL，設計2個重復實驗，置于恒溫搖床，在40℃、100 rad/min條件下培養(yǎng)48 h[2]。

(8) 玉米芯的1.0%H2SO4強化纖維素酶預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，設計2個重復實驗，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預處理1 h，冷卻后用NaOH溶液調節(jié)液體pH至5.5，然后加入纖維素酶1 mL，置于40 ℃、100 rad/min恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。

(9) 玉米芯的1.0%H2SO4強化半纖維素酶預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，設計2個重復實驗，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預處理1 h，冷卻后用NaOH溶液調節(jié)液體pH至4.8，然后加入半纖維素酶0.1 mL，置于40 ℃、100 rad/min 恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。

(10) 玉米芯的1.0%H2SO4強化半纖維素酶協同纖維素酶預處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，設計2個重復實驗，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預處理1 h，冷卻后用NaOH溶液調節(jié)液體pH至5.0，然后加入纖維素酶1 mL、半纖維素酶0.5 mL，置于40 ℃、100 rad/min 恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。

1.4 分析方法

采用 DNS 法(3，5-二硝基水楊酸法)[3]進行葡萄糖含量的測定，采用環(huán)境掃描電鏡觀察玉米芯試樣噴金后的纖維表面形態(tài)變化[4]，采用傅立葉變換紅外光譜儀掃描預處理后的玉米芯樣品，觀察纖維素結晶結構變化情況[5]。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖含量的測定

用蒸餾水按適當倍數稀釋離心后的玉米芯水解液，取適量溶液，按 DNS 法(3，5-二硝 基水楊酸法)測定葡萄糖含量，計算葡萄糖轉化率，結果見表1。

表1 不同預處理方法下玉米芯水解液的葡萄糖轉化率 %

由表1數據可以看出：

(1) 在蒸餾水加壓處理下，玉米芯水解液中雖有葡萄糖檢出，但是含量不高。

(2) 1.0%H2SO4處理，由于纖維素和半纖維素在酸性條件下穩(wěn)定性較低，在一定的溫度和壓強下對其降解產生的葡萄糖較多，所以此種情況的玉米芯水解液中葡萄糖含量較高。

(3) 1.0%NaOH 處理，因為堿主要對木質素起作用，對纖維素和半纖維素的影響不大，所以經堿預處理后的玉米芯水解液中葡萄糖含量較低。

(4) 微生物處理，因為微生物既能分泌出纖維素酶，又能分泌出半纖維素酶，所以玉米芯水解液中葡萄糖含量較高。

(5) 直接酶法處理，半纖維素酶法處理效果不太好，較纖維素酶法處理效果差，而半纖維素酶協同纖維素酶法處理效果較好，水解效率較高，水解后溶液中的葡萄糖含量比單一的半纖維素酶法和纖維素酶法處理后高。

(6) 1.0% H2SO4強化酶法處理，經稀酸預處理后，纖維素和半纖維素部分被水解到溶液中，酶與纖維素和半纖維素接觸更有效，酶解效率明顯提高，可見稀酸強化酶法預處理效果較好。

綜上所述，與堿法及直接酶法相比較，稀酸法預處理效果更好；直接酶法與稀硫酸強化酶法相比較，稀硫酸強化酶預處理效果更佳。另外，在半纖維素酶的協同作用下，纖維素酶的水解作用進一步提升。在10種預處理方法中，1.0% H2SO4強化半纖維素酶協同纖維素酶法預處理效果最佳，其次是1.0%H2SO4強化纖維素酶法，最后是1.0%H2SO4法。綜合考慮經濟成本，最優(yōu)方法是1.0%H2SO4預處理法。

2.2 玉米芯的紅外吸收光譜分析

圖1為玉米芯的紅外吸收光譜圖。由圖1可見，經1.0% H2SO4、1.0% NaOH、半纖維素酶預處理后玉米芯的紅外吸收光譜圖與經原料玉米芯、蒸餾水預處理玉米芯的紅外吸收光譜圖相比，其中相同點為：3 350 cm-1附近出現的吸收峰是形成氫鍵的羥基的伸縮振動吸收峰，這是纖維素中纖維的特征譜帶；2 900 cm-1附近出現的吸收峰屬于纖維素中亞甲基基團的伸縮振動吸收峰。在3 350 cm-1和2 900 cm-1處的吸收峰強度變弱，表明碳水化合物部分分解，致使羥基和亞甲基基團減少。不同點主要有：① 1 700 cm-1處為羰基伸縮振動吸收峰，對比預處理前后該吸收峰發(fā)現，經1.0% H2SO4和1.0%NaOH預處理后，該峰強度有所降低，但用酶處理后此處吸收峰基本消失，說明玉米芯的羧酸酯類化合物和酮類化合物在預處理時較大部分被水解。② 1 500 cm-1附近出現的吸收峰為苯環(huán)芳香核振動吸收峰，經1.0% H2SO4和酶預處理后，該峰強度有所下降，而用1.0%NaOH預處理后這個峰基本消失，說明預處理對木質素有一定的破壞，而1.0%NaOH對木質素的破壞最大。③ 纖維素組分最重要的兩個特征峰為1 420 cm-1處吸收峰(纖維素中無定形區(qū)結構及纖維素Ⅱ構型)和1 430 cm-1處吸收峰(纖維素Ⅰ結晶區(qū)構型)。其中，經1.0%NaOH預處理后，1 430 cm-1處吸收峰強度有所增強，這說明經堿處理后樣品結晶結構比例有所增長。而經1.0% H2SO4預處理后，1 430 cm-1處吸收峰強度有所下降，這說明經酸處理后樣品結晶結構部分被破壞。④ 經1.0% H2SO4預處理后，1 255 cm-1、1 100 cm-1和898 cm-1處的吸收峰都下降為肩狀，表明此種情況下玉米芯中的纖維素、半纖維素、糖類及其他碳水化合物部分被分解。這些結論與文獻[5-6]中所報道的結果較一致。

綜上所述，經不同方法預處理后玉米芯的結構均有變化，其中經1.0% H2SO4預處理后的變化較大，如碳水化合物分解，羧酸酯類化合物和酮類化合物水解，對木質素有一定的破壞，結晶結構破壞、纖維素、半纖維素、糖類及其他碳水化合物部分被分解等等。這些變化說明，用1% H2SO4預處理玉米芯有利于其后續(xù)發(fā)酵。

a.原料玉米芯；b.蒸餾水預處理玉米芯；c.1.0% H2SO4預處理玉米芯；d.1.0% NaOH預處理玉米芯；e. 半纖維素酶協同纖維素酶預處理玉米芯圖1 玉米芯紅外吸收光譜譜圖

2.3 玉米芯纖維表面形態(tài)的掃描電鏡分析

通過比較同一放大倍數(1 000×)不同預處理方法下的玉米芯纖維表面形態(tài)的掃描電鏡譜圖(圖2)發(fā)現：原料玉米芯纖維的原始形貌清晰可見，纖維沒有斷裂，也未發(fā)現微孔(圖2(a))；經蒸餾水預處理后玉米芯的表面形貌明顯較原料玉米芯粗糙，出現極少部分微孔，未觀察到纖維斷裂(圖2(b))；經1.0%H2SO4預處理后玉米芯纖維的結晶結構明顯被破壞，纖維表面出現分絲甚至斷裂現象，且出現了許多孔洞(圖 2(c)和圖3)。這個結果與文獻[7]中所報道的現象較為一致。出現這種現象的原因是H2SO4脫除了大部分半纖維素，破壞了纖維素的結晶結構，說明1.0%H2SO4預處理法對玉米芯的后續(xù)發(fā)酵起到積極作用，是玉米芯水解的好方法。

(a) 原料玉米芯 (b) 蒸餾水預處理玉米芯 (c)1% H2SO4預處理玉米芯圖2 玉米芯纖維表面形態(tài)的掃描電鏡譜圖

(a) 200× (b)500×

(c) 1000× (d) 3000×圖3 不同放大倍數下1.0%H2SO4預處理玉米芯的掃描電鏡譜圖

3 結 論

(1) 在10 種預處理方法中，1.0% H2SO4強化半纖維素酶協同纖維素酶預處理效果最佳，其次是1.0% H2SO4強化纖維素酶法，最后是1.0% H2SO4法。綜合考慮經濟成本，最優(yōu)方法為1.0% H2SO4預處理法。

(2) 通過紅外吸收光譜分析經1.0% H2SO4預處理后玉米芯的變化可知：碳水化合物分解，羧酸酯類化合物和酮類化合物水解，對木質素有一定的破壞，結晶結構破壞，纖維素、半纖維素、糖類及其他碳水化合物部分被分解，這些變化說明用1.0% H2SO4預處理玉米芯非常有利于其后續(xù)發(fā)酵。

(3) 通過掃描電鏡觀察發(fā)現，經1.0% H2SO4預處理后玉米芯的形貌發(fā)生了明顯形態(tài)學上的變化：大部分半纖維素被脫除，纖維素的結晶結構明顯被破壞。