高雅莉　莊奕筠　許秋霞

[摘要] 目的 建立反相高效液相色譜法測定人血清中奧卡西平（OXC）活性代謝產物MHD的濃度。 方法 收集血清樣品經甲醇沉淀蛋白后，采用InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）色譜柱，流動相為甲醇-水（35：65），流速：0.8 mL/min，檢測波長：210 nm，柱溫：40℃，進樣體積：20 μL。 結果 血清中內源性物質對樣品測定無干擾，MHD 在4.8～38.4 μg/mL線性關系良好，回歸方程為：A=13968.3C-13730.7，r=0.9990。MHD的低、中、高3種濃度平均回收率均>95%，日內、間 RSD 均<3%（n=5）。 結論 反相高效液相色譜法簡便、準確、靈敏度高，適用于人體內奧卡西平活性代謝產物MHD的血藥濃度監(jiān)測。

[關鍵詞] 奧卡西平；10，11-二氫-10-羥基卡馬西平；活性代謝產物；反相高效液相色譜法；血藥濃度

[中圖分類號] R969 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）12-0042-03

Determination of active metabolites of oxcarbazepine in human serum by reversed-phase high performance liquid chromatography

GAO Yali ZHUANG Yiyun XU Qiuxia CHEN Xi

Department of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

[Abstract] Objective To establish reversed-phase high performance liquid chromatography method for the determination of oxcarbazepine（OXC） active metabolite MHD concentration in human serum. Methods The serum samples were collected and the protein was precipitated by methanol， then InertSustain C18（5 μm， 4.6×150 mm） chromatography column was used， and the mobile phase was methanol-water（35：65）， flow rate： 0.8mL/min， detection wavelength： 210 nm， column temperature： 40°C， injection volume： 20 μL. Results The endogenous substances in serum did not interfere with the determination of the samples. The linearity of MHD was good from 4.8 to 38.4 μg/mL. The regression equation was： A=13968.3C-13730.7， r=0.9990. The average recoveries of MHD at low， medium， and high concentrations were all> 95%， and intra-and inter-day RSDs were <3%（n=5）. Conclusion The reversed-phase high performance liquid chromatography method is simple， accurate and sensitive， which is suitable for monitoring the plasma concentration of MHD， an active metabolite of oxcarbazepine.

[Key words] Oxcarbazepine；10， 11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine；Active metabolites； Reversed-phase high performance liquid chromatography；Serum concentration

癲癇是一組由于腦部神經元異常過度放電所引起的突然、短暫、反復發(fā)作的中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）功能失常的慢性疾病和綜合征[1]，是一類嚴重影響人類身心健康的神經系統(tǒng)疾病。目前，癲癇患者控制癲癇發(fā)作的最重要手段仍然是服用抗癲癇藥物。奧卡西平（oxcarbazepine，OXC）是一種新型的抗癲癇藥物，是卡馬西平（carbamazepine，CBZ）的10-酮基衍生物（圖1），2000年1月由美國FDA批準上市。OXC不良反應的發(fā)生率顯著低于CBZ[2]，且耐受性好，對肝藥酶誘導作用較弱，藥物相互作用少，可作為傳統(tǒng)抗癲癇藥的替代藥物[3]。OXC在服用后，迅速且?guī)缀跬耆亟到鉃樗幚砘钚源x產物10，11-二氫-10-羥基卡馬西平（monohydroxycarbazepine，MHD）（圖2）。在人體進行的一項物質平衡研究中，OXC原型僅占血清中總放射活性的2%[4]，因此在臨床上可通過測定血清中MHD血藥濃度來判斷OXC的療效和不良反應。為了解MHD在體內的藥動學特征和進行血藥濃度監(jiān)測，本研究參考國內外相關文獻，簡化血樣前處理，優(yōu)化色譜條件，建立了RP-HPLC法測定人血清中MHD濃度，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-30AD高效液相色譜系統(tǒng)：包括DGU-20A5R脫氣機、SIL-30AC自動進樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測器、CTO-30A柱溫箱、LC-30AD二元泵以及LC solution色譜工作站；XH-B型漩渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；離心機（10900/min，德國ABBOTT公司）；METTLER AE240電子天平。

1.2 試劑與試藥

奧卡西平片（商品名為曲萊，Novartis Pharma Schweiz AG，規(guī)格300 mg/片）；MHD對照品（南京康滿林生物醫(yī)藥科技有限公司，純度約為96%，批號：20131227）；甲醇（HPLC級，美國TEDIA公司）；純化水（本實驗室自制）；空白血漿（健康體檢者的混合血漿）；其他試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）；流動相：甲醇-水（35：65）；流速：0.8 mL/min；二極管陣列檢測器波長：210 nm；柱溫：40℃；進樣體積：20 μL。

1.3.2 對照品溶劑的配制 精密稱取MHD標準品適量放在燒杯中，用少量甲醇溶解后轉移至10 mL容量瓶中，用甲醇多次洗滌燒杯，并把洗滌溶液全部轉移到容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成0.96 mg/mL（此濃度經過純度折算）的標準儲備液，轉移至棕色瓶后置冰箱4℃貯存。臨用時，用甲醇稀釋成濃度為96 μg/mL的工作液。

1.3.3 標準血清樣品的制備及前處理 分別精密量取96 μg/mL的MHD工作液適量，用甲醇稀釋得到含MHD 4.8、9.6、14.4、19.2、28.8、38.4 μg/mL標準工作液。精密移取空白血清200 μL置于1.5 mL EP管中，分別加入200 μL上述已配置好的不同濃度標準工作液，旋渦混勻1 min，加入600 μL甲醇，旋渦混勻1 min，10900 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm微孔濾器濾過，進樣上機。

1.3.4 血清樣品前處理 精密量取患者血清樣品200 μL置于1.5 ml EP管中，加入800 μL甲醇沉淀蛋白，旋渦混勻1 min，10900 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm微孔濾器濾過，進樣上機。

2 結果

2.1 方法的專屬性

在選定的血樣前處理方法和色譜分離條件下，得到空白血清（A）、空白血清加入MHD對照品（B）、患者服藥后血樣（C）的色譜圖見圖3?？梢娫诒緦嶒灄l件下MHD的保留時間為15.25 min，血清中內源性物質對MHD的測定無干擾，色譜峰形較好，分離完全。

2.2 標準曲線的制備

取含MHD的系列標準工作液，按“1.3.3”項下方法操作后，進樣測定，記錄色譜圖。以樣品峰面積（A）對質量濃度（C）作線性回歸，得標準曲線回歸方程A=13968.3C-13730.7，r=0.9990，結果表明血清中MHD在4.8～38.4 μg/mL線性關系良好。

2.3 方法回收率和精密度

分別精密量取96 μg/mL的MHD工作液適量，用甲醇稀釋得到含MHD7.2、12、24 μg/mL低、中、高3種質控溶液，每個濃度平行配制5份，按“1.3.3”項下方法操作，進樣分析，各濃度分別在同一日內測定，連續(xù)測定5 d。根據(jù)所得圖形峰面積（A）代入相應的標準曲線中求得各樣品濃度，以日內測得的實測濃度計算日內RSD，不同日測得的實測濃度計算日間RSD，以實測濃度與理論濃度的比值計算方法回收率。MHD的低、中、高3種濃度平均回收率均>95%，日內、日間RSD均<3%（n=5），見表1。

2.4 臨床應用

應用建立的RP-HPLC法測定OXC活性代謝產物MHD在體內的穩(wěn)態(tài)谷濃度水平，測定時血中雜質無干擾。2016年1月～2017年12月共收集77例門診及住院病例，其中在有效血藥濃度范圍內（《中國藥典·臨床用藥須知·化學藥和生物制品卷》（2010年版）推薦值為10～35 μg/mL[6]）的占46.75%（36/77），<10 μg/mL占53.25%（41/77），最低為1.11 μg/mL，>35 μg/mL占0。結果顯示OXC在按常規(guī)劑量給藥的情況下，存在部分患者血藥濃度在有效濃度范圍外，因此，需要在血藥濃度監(jiān)測下調整給藥劑量，本方法能夠滿足臨床血藥濃度監(jiān)測，也能用于患者過量服藥情況下的中毒藥物濃度監(jiān)測，從而為患者制定個體化用藥方案。

3 討論

從奧卡西平的藥動學特征來看，口服OXC后，其活性代謝產物MHD一般在2～3 d內達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。本文對癲癇患者口服OXC片后進行TDM，在給藥前采集血樣測定人血清中MHD穩(wěn)態(tài)谷濃度水平。MHD在人血清中的血藥濃度測定方法已有文獻報道，通常采用LC-MS/MS法[7]和HPLC法[8-16]。LC-MS/MS專屬性強、靈敏度高，但由于成本昂貴，不適用于常規(guī)檢測。目前國內關于MHD藥物濃度測定的HPLC法大多采用內標法進行測定[9-11，16]，操作較為繁瑣，本文采用外標法進行測定，實驗結果表明該方法簡便快捷，也能準確地測定MHD的血藥濃度。

MHD結構中有兩個苯環(huán)，具有明顯的紫外吸收。本實驗在200～360 nm的波長范圍內進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)檢測波長為210 nm時，基線平穩(wěn)，吸收值較大，靈敏度較高，因此選取210 nm作為檢測波長。采用甲醇-水為流動相，按照不同配比進行檢測，發(fā)現(xiàn)甲醇-水（35：65）時，血清中內源性雜質對樣品測定無干擾，色譜峰最為理想。血樣預處理方法包括固相萃取法[8]、液液萃取法[9-12]和蛋白沉淀法[13-16]。固相萃取法費用較高，操作繁瑣；液液萃取法處理具有易乳化、易造成過程污染、提取不完全等缺點。本文采用有機溶劑蛋白沉淀法，操作簡便、快速、成本較低，通過對文獻報道的測定方法進行改進，采用甲醇[14-16]沉淀蛋白，采集血清量少，試劑價廉，毒性低，離心后直接取上清液進樣，色譜分離好，方法簡便、準確、靈敏度高、重復性好，適用于臨床血藥濃度監(jiān)測。

綜上所述，抗癲癇治療是一個長期的過程，我院目前開展奧卡西平的血藥濃度監(jiān)測，既是醫(yī)生了解患者用藥依從性的一種手段，同時也是醫(yī)生監(jiān)測患者治療效果的一種方式，有助于醫(yī)生針對個體癲癇患者調整用藥方案，提高治療效果，降低不良反應發(fā)生率。

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（收稿日期：2017-11-28）