余自琳,郭榮燦,姜 毅,白云霞,劉小玲,*,趙謀明

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530000;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510641)

墨魚又稱烏賊,是海洋動(dòng)物中頭足類的一種,其分布地域廣泛,是我國(guó)主要海產(chǎn)之一。研究表明,它不但具有較高的食用價(jià)值,同時(shí)也具有較好的抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等作用[1-5]。目前市場(chǎng)上以墨魚為原料的加工食品較少,其原因是在加工過(guò)程中其因蛋白質(zhì)的降解會(huì)產(chǎn)生較重的腥氣,影響食用,這一現(xiàn)象限制了墨魚的深加工。美拉德反應(yīng)是一種非酶促褐變現(xiàn)象,是羰基化合物與氨基化合物之間的反應(yīng),它能賦予食物獨(dú)特的風(fēng)味[6],在食品的加工與儲(chǔ)存中起著非常重要的作用,目前已廣泛應(yīng)用于肉味、海鮮味香精的制作。所以用美拉德反應(yīng)的方式制備香精可以改善墨魚加工中的不良風(fēng)味,同時(shí)賦予其特殊的風(fēng)味。吳靖娜[7]等將鮑魚蒸煮液與木糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后,得到產(chǎn)物豐富、風(fēng)味獨(dú)特的海鮮調(diào)味品基料。而王茵[8]等用花蛤蒸煮液經(jīng)美拉德反應(yīng)后得到花蛤香味濃郁的產(chǎn)物,適合各種海鮮調(diào)味品的開發(fā)。同時(shí),在美拉德反應(yīng)的影響因素中,初始pH為最重要的一種[9],其對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物影響最大。本研究以墨魚水解物和葡萄糖-木糖混合糖為原料,通過(guò)感官評(píng)價(jià)、GC-MS、電子鼻和全自動(dòng)氨基酸分析對(duì)不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,為開發(fā)新型墨魚味海鮮調(diào)味料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨魚仔 單只50～80 g,廣西大學(xué)南百超市;復(fù)合蛋白酶500 mg(3760000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶500 g(258000 U/g) 丹麥諾維信酶制劑公司;D-(+)-木糖、葡萄糖,純度≥99% 上海源葉生物科技有限公司;C6～C33正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純 美國(guó)Supelco公司;氨基酸分析洗脫液 日立高新技術(shù)公司;其余試劑 均為分析純。

SHZ-8恒溫振蕩器 國(guó)華企業(yè);TD5A-WS低速離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司;DGG-9100 GD 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;7890B型GC儀、5977A型MS儀 美國(guó)安捷倫公司;57310-U型65 μm DVB萃取頭 美國(guó)Supelco公司;L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日立高新技術(shù)公司;5810型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;PEN3型便攜電子鼻 德國(guó)Asrinese公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 墨魚酶解液制備 酶解方法參考王君研[10]的方法,稍加改動(dòng)。墨魚取軀干與腕部肌肉部分,洗凈煮熟后勻漿,料液比為1∶3 (g/mL),調(diào)節(jié)pH至7.0,按底物質(zhì)量的0.3%加入風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶(1∶1),置于恒溫振蕩器中55 ℃酶解6 h后100 ℃滅酶10 min。4000 r/min離心20 min后取上清液,得到墨魚酶解液。

1.2.2 美拉德反應(yīng) 將鼓風(fēng)干燥箱溫度控制在120 ℃,按照木糖:葡萄糖質(zhì)量比1∶1,添加還原糖,添加量為酶解液質(zhì)量的3%,調(diào)節(jié)反應(yīng)初始pH分別為5、6、7、8、9、10,反應(yīng)時(shí)間為60 min,進(jìn)行美拉德反應(yīng),同時(shí)通過(guò)考察反應(yīng)產(chǎn)物的感官特性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、風(fēng)味特征和游離氨基酸含量,分析不同pH下墨魚酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味變化。

1.2.3 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)參照陳德慰[11]的方法,稍加改動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)僅考察嗅覺(jué)器官與味覺(jué)器官感受到的產(chǎn)物特性。根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì),確定產(chǎn)物的五個(gè)感官指標(biāo),分別是腥味、甜味、苦味、糊味和鮮味,并對(duì)以上五個(gè)指標(biāo)采用六分的標(biāo)度進(jìn)行感官分析,具體感官評(píng)分表如表1。

表1 感官評(píng)價(jià)得分表

感官評(píng)價(jià)由本實(shí)驗(yàn)室6名食品專業(yè)人員組成,其均為研究食品風(fēng)味方面的人員,接受過(guò)感官評(píng)價(jià)培訓(xùn),評(píng)價(jià)結(jié)果具有可靠性。取得分的平均值作為對(duì)應(yīng)的得分。

1.2.4 電子鼻分析 取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物20 mL置于100 mL燒杯中,密封后置于50 ℃水浴中加熱10 min后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件如下:傳感器室流量300 mL/min,測(cè)量樣品流量300 mL/min,氣流量 400 mL/min,傳感器自動(dòng)清洗時(shí)間120 s;清洗時(shí)間120 s,測(cè)量時(shí)間90 s,頂空溫度25 ℃。

1.2.5 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定參考L Cai[12]的方法,稍加改動(dòng)。頂空固相微萃取(SPME)條件:將5 mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與1 g NaCl裝入10 mL SPME專用瓶中,55 ℃條件下磁力攪拌加熱20 min,萃取30 min,結(jié)束后立即將萃取頭插入230 ℃進(jìn)樣口解析3 min。

GC條件:DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為氦氣(99.999%);載氣流速1.0 mL/min;不分流,進(jìn)樣口溫度:230 ℃;升溫程序:初溫40 ℃保持4 min,以5 ℃/min升至230 ℃后保持5 min。

MS條件:電離源為電噴霧電離,離子阱溫度150 ℃,GC-MS傳輸線溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍45～550 u,掃描速率0.220 s/scan。電噴霧電離電子能量70 eV。

揮發(fā)性化合物的定性與定量:選擇NIST14.0譜庫(kù)檢索結(jié)果匹配度大于80的化合物,并根據(jù)C6～C33的正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間,計(jì)算化合物的保留指數(shù)(RI),并在The LRI Database on the Web[13]與NIST Chemistry WebBook[14]網(wǎng)上有統(tǒng)計(jì)報(bào)道文獻(xiàn)的香味化合物RI的數(shù)據(jù)庫(kù)中,進(jìn)行比對(duì)定性,同時(shí)用峰面積歸一化法計(jì)算物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行定量。

1.2.6 游離氨基酸含量分析 取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物1.000 mL加入1.000 mL 10%的三氯乙酸沉淀20 min后在4 ℃下10000 r/min離心20 min,取上清液,通過(guò)0.22 μm水系過(guò)濾器后上機(jī)分析。主要檢測(cè)參數(shù)如下:日立高效液相色譜柱(4.6 mm×60 mm,1 μm);柱溫:135 ℃;進(jìn)樣體積:20 μL;泵流速:0.4 mL/min;雙通道檢測(cè)570 nm和440 nm;分析時(shí)間:53 min。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)差異性進(jìn)行分析,每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn),采用單因素方差分析(ANOVA)兩兩比較中 Duncan分析每組之間是否有顯著性差異(p<0.05),采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。采用Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)分析

圖1是不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)得分雷達(dá)圖。由圖1可知,在初始pH5～8范圍內(nèi),隨著pH的升高,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物鮮味得分逐漸升高,甜味得分先升高再降低,苦味與腥味得分逐漸降低,在初始pH達(dá)到8時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物鮮味突出,苦味與糊味不存在。在初始pH9～10時(shí),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物糊味得分升高,鮮味與甜味得分降低,當(dāng)初始pH為10時(shí),產(chǎn)物甜味最突出,苦味不存在。通過(guò)以上分析可知,初始pH過(guò)高(>8)與過(guò)低(<6)均使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物整體鮮味不突出,當(dāng)pH為7時(shí),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物腥味、苦味與糊味不突出,鮮味與甜味最突出。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與孫方達(dá)[15]等研究結(jié)果相似。

圖1 不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)得分雷達(dá)圖

2.2 電子鼻結(jié)果分析

電子鼻是食品氣味特征分析中常用的儀器,不同傳感器對(duì)不同氣味物質(zhì)的靈敏不同,因此可以比較不同氣味的差異。由圖2知,主成分1貢獻(xiàn)率為64.18%,主成分2貢獻(xiàn)率為30.32%,主成分1與主成分2貢獻(xiàn)率之和達(dá)到94.5%,能夠較好地反映原始數(shù)據(jù)的信息,說(shuō)明電子鼻實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以代表全部樣品的整體信息。在主成分1上,從距離上看,pH5與pH7的樣品與其余四個(gè)樣品的差距較大,說(shuō)明這兩個(gè)pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的氣味成分與其余樣品的氣味成分上差距明顯;在主成分2上,pH5、pH8、pH9和pH10的樣品與pH6、pH7的樣品差距較大,但pH9與pH10的樣品之間相互有重疊,說(shuō)明pH5、pH8、pH9和pH10的樣品這四個(gè)pH下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的氣味成分與其余兩個(gè)pH下產(chǎn)物的氣味成分相差大,但pH9與pH10的樣品相互差異較小。

圖2 不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電子鼻PCA圖

不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物G/G0值如表2所示,除4號(hào)傳感器所代表的氫化物與5號(hào)傳感器所代表的烷烴芳香成分之外,電子鼻其余傳感器不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味物質(zhì)響應(yīng)值均有顯著性差異(p<0.05)。其中pH5與pH8的樣品在4號(hào)傳感器上無(wú)顯著性差異(p>0.05),其余pH的樣品在4號(hào)傳感器上差異顯著(p<0.05);除pH10的樣品外,其余pH樣品在5號(hào)傳感器上無(wú)顯著性差異(p>0.05)。說(shuō)明不同pH反應(yīng)條件下,美拉德反應(yīng)的風(fēng)味產(chǎn)物差異較大。為明確不同pH條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味成分的具體變化,進(jìn)一步采用GC-MS分析并鑒定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

表2 不同初始pH下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物G/G0響應(yīng)值

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)果分析

低分子量揮發(fā)性化合物是食品氣味中重要的香氣成分,其種類和含量是影響食品風(fēng)味的關(guān)鍵因素。由表3可知,在本實(shí)驗(yàn)中,共檢測(cè)出54種揮發(fā)性化合物,其中醛類23種、酮類8種、醇類8種、呋喃類6種、吡嗪類4種、噻唑類1種、含氮化合物1種、吡咯1種、含硫化合物2種。

表3 不同pH下美拉德反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物分析

續(xù)表

醛類物質(zhì)中因其閾值低的特點(diǎn),被認(rèn)為是風(fēng)味物質(zhì)中的主要貢獻(xiàn)物[16]。其在美拉德反應(yīng)中主要由氨基酸經(jīng)過(guò)斯特雷克降解形成的α-氨基酮通過(guò)縮合而成[17]。本實(shí)驗(yàn)中,在初始pH5～7條件下,隨著pH升高,醛類物質(zhì)相對(duì)含量由58.25%增加至60.9%;在初始pH8～10條件下,隨著pH升高,醛類物質(zhì)相對(duì)含量由54.29%降低至26.62%?？赡艿脑蚴?在高pH的條件下,醛與其他物質(zhì)進(jìn)入了反應(yīng)中級(jí)階段,生成了終產(chǎn)物類黑精。孫麗平等[18]也指出美拉德反應(yīng)速度隨介質(zhì)pH的升高而增大。其中可貢獻(xiàn)醬香和肉香的3-甲硫基丙醛在初始pH5～8條件下生成,它同時(shí)也是牛肉香氣的特征化合物[19];可同時(shí)貢獻(xiàn)麥芽香與可可香的2-甲基丁醛與3-甲基丁醛在pH9和10的條件下相對(duì)含量達(dá)到最高,結(jié)合2.1中感官評(píng)價(jià),在pH達(dá)到9和10時(shí),產(chǎn)物主要呈現(xiàn)糊味,與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

在本實(shí)驗(yàn)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中,在初始pH5的條件下,產(chǎn)物中呋喃類物質(zhì)相對(duì)含量為28.26%,吡嗪類物質(zhì)相對(duì)含量為0。隨著初始pH升高,呋喃類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸降低,吡嗪類物質(zhì)含量逐漸升高。在初始pH10的條件下,呋喃類物質(zhì)相對(duì)含量為0.60%,吡嗪類物質(zhì)相對(duì)含量為18.41%?？赡艿脑蚴?在酸性環(huán)境中,還原糖經(jīng)阿馬多爾重排并脫氨后,斷裂成醛酮類或自身環(huán)化成糠醛類化合物[[20],但是氨基在酸性環(huán)境中不能發(fā)生親和反應(yīng),所以吡嗪在較高pH條件下形成[21]。其中2-乙基呋喃、2-戊基呋喃和順式-2-(2-戊烯基)呋喃在初始pH5～7條件下相對(duì)含量高于初始pH8～10,并且2-乙基呋喃與2-戊基呋喃為產(chǎn)物提供焦香、豆香和果香;3-甲基吡嗪與2,5-二甲基-吡嗪在pH9與10中相對(duì)含量高于其他pH,二者可為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提供燒烤和肉類香味。

醇類物質(zhì)因其閾值高,所以在香氣成分中貢獻(xiàn)作用較小[22],但是對(duì)食物整體香味有調(diào)和作用,使香味整體更加飽滿圓潤(rùn),其來(lái)源是脂肪氧化[23]或者羰基化合物還原[24]。在本實(shí)驗(yàn)中,在初始pH5～9條件下,隨著pH升高,醇類物質(zhì)相對(duì)含量由6.70%增加至12.08%;當(dāng)初始pH達(dá)到10時(shí),相對(duì)含量降低至0.67%。1-辛烯-3-醇是典型海鮮香精調(diào)配中的主要特征化合物[25],同時(shí)在初始pH5～7條件下,1-辛烯-3-醇相對(duì)含量明顯高于初始pH8～10,在初始pH7時(shí)相對(duì)含量最高,在初始pH5～9條件下檢測(cè)出的苯乙醇可為產(chǎn)物貢獻(xiàn)花香。在美拉德反應(yīng)中,酮類物質(zhì)被認(rèn)為來(lái)自糖降解。在pH8條件下,酮類物質(zhì)相對(duì)含量達(dá)到最高,為6.06%,在初始pH達(dá)到9與10時(shí),酮類物質(zhì)種類與含量低于初始pH5～8。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出的2-辛酮、3-辛酮和2-壬酮等化合物可為產(chǎn)物貢獻(xiàn)脂肪香、干草香和果香等協(xié)調(diào)香。

含硫物質(zhì)與三甲胺是典型的海鮮香味物質(zhì)。在初始pH5～10條件下,隨著pH升高,含硫化合物相對(duì)含量由0增加至12.33%,三甲胺相對(duì)含量由0.05%增加至32.79%。其中二甲基二硫化物與二甲基三硫化物閾值低,但是對(duì)海鮮香味貢獻(xiàn)大。已有研究表明,這三種物質(zhì)存在于熱加工的海產(chǎn)品中[26],是海鮮風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)。

2.4 游離氨基酸含量分析

游離氨基酸是生物體中游離出來(lái)的氨基酸,并且大都具有一定的滋味特征。由表4可知,本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)出16種游離氨基酸,除脯氨酸、亮氨酸和色氨酸外,其余氨基酸均在產(chǎn)物中被檢出。在pH5～7的范圍內(nèi),隨著初始pH的升高,總游離氨基酸含量由5.725 mg/mL增加至6.303 mg/mL,苦味氨基酸與鮮味氨基酸含量均有增加;在pH8～10的范圍內(nèi),隨著初始pH的升高,總游離氨基酸含量由5.948 mg/mL降低至4.945 mg/mL,其中鮮味氨基酸與苦味氨基酸含量均隨著pH的升高而降低。在美拉德反應(yīng)過(guò)程中,肽熱降解會(huì)生成氨基酸,氨基酸會(huì)參與反應(yīng)或降解成其他物質(zhì),反應(yīng)初始pH越高,美拉德反應(yīng)速度越快,所以在pH偏高時(shí),游離氨基酸含量降低。雖然鮮味氨基酸含量不能完全代表產(chǎn)物鮮味強(qiáng)度,因?yàn)槌术r味的物質(zhì)還包括核苷酸和肽等[27],但是結(jié)合2.1節(jié)中的感官評(píng)價(jià)結(jié)果,鮮味氨基酸含量可以反映出鮮味物質(zhì)的變化規(guī)律[28]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中苦味氨基酸含量較高,但是在感官評(píng)價(jià)中苦味確不突出,這與之前學(xué)者[29]研究結(jié)果吻合。

表4 不同初始pH下美拉德反應(yīng)游離氨基酸含量分析(mg/mL)

Kam Huey Wong[30]等研究表明,在酸性pH條件下,不同氨基酸與葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味不同。在pH5.2條件下,苯丙氨酸與酪氨酸可產(chǎn)生玫瑰花香;精氨酸可產(chǎn)生水果香;異亮氨酸可產(chǎn)生燒焦香味,賴氨酸與纈氨酸可產(chǎn)生令人愉快的焦糖香氣。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中,以上幾種氨基酸含量較高,并且結(jié)合前面2.3節(jié)中揮發(fā)性產(chǎn)物分析,在pH范圍5～6的條件下,產(chǎn)物中苯乙醛呈現(xiàn)玫瑰花香,2-乙基-呋喃與2-戊基-呋喃呈焦糖香氣等,產(chǎn)物中的游離氨基酸種類與含量對(duì)產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)影響較大。

3 結(jié)論

通過(guò)研究不同初始pH對(duì)墨魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味物質(zhì)表明,不同初始pH對(duì)產(chǎn)物風(fēng)味物質(zhì)影響較大。在偏酸性反應(yīng)條件下,隨著反應(yīng)初始pH的增加,產(chǎn)物鮮味逐漸增加,揮發(fā)性化合物中醛類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸升高(由58.25%增加至60.9%),呋喃類物質(zhì)逐漸降低(由28.26%降低至16.95%),游離氨基酸總量逐漸升高(由5.725 mg/mL增加至6.303 mg/mL)。在偏堿性反應(yīng)條件下,隨著反應(yīng)初始pH增加,產(chǎn)物鮮味逐漸降低,揮發(fā)性化合物中醛類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸降低(由54.29%降低至26.62%),吡嗪類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸升高(由0增加至18.41%),游離氨基酸總含量逐漸降低(由5.948 mg/mL降低至4.945 mg/mL)。在pH7的條件下,產(chǎn)物腥糊味低,鮮甜味突出,醛類物質(zhì)相對(duì)含量最高(60.9%),同時(shí)游離氨基酸含量也達(dá)到最高(6.303 mg/mL),典型海鮮風(fēng)味的揮發(fā)化合物在pH10的條件下相對(duì)含量最高(三甲胺、含硫化合物分別為32.79%、12.33%)。通過(guò)美拉德反應(yīng)制備的熱反應(yīng)產(chǎn)物具有良好的風(fēng)味與較高的氨基酸含量,可廣泛應(yīng)用于熱反應(yīng)型香精香料的制備,具有較好的市場(chǎng)前景與商業(yè)價(jià)值。